研究目的 血管新生是体内重要的病理生理过程,在肿瘤的转移浸润以及缺血性疾病的血运重建等病理生理过程中发挥着十分重要的作用,它是指内皮细胞通过增殖和分化在原有血管基础上以芽生或非芽生的形式生成血管。目前关于血管形成的基本机制还存在争议,但是整合素在血管形成的过程中发挥重要的作用这一观点已得到认同。整合素是位于细胞表面的异二聚体粘着受体,与胞外基质蛋白相结合,由一个α亚基和一个β亚基组成,α3β1和α6β1是层粘连蛋白连接整合素,可以和四跨膜超家族蛋白（tetraspanins）形成复合体。CD151是四跨膜超家族蛋白（TM4SF）的最重要成员之一,他可以通过通过胞外大环特异性位点QRD194-196与整合素α3β1或α6β1相连,形成CD151–α3β1/α6β1功能性复合体,进而调节内皮细胞的增殖、迁移、粘附功能以及信号转导通路,我们过去的研究表明CD151能促进缺血心肌和缺血后肢组织的血管新生,改善这些组织器官的功能。有研究表明CD151抗体也可以抑制内皮细胞的迁移过程,相似的结果也可以在应用整合素α3抗体的内皮细胞中观察到,基于这些发现,我们推测切断CD151与整合素α3β1,α6β1之间的连接可以抑制血管新生。在本研究中,我们构建了整合素α3/α6结合缺陷的CD151–QRD194-196→AAA,通过重组腺相关病毒载体（Recombinant adeno-associated virus,rAAV）将CD151–QRD194-196→AAA突变体转染至大鼠后肢肌肉组织中,然后建立后肢缺血模型,观察CD151突变体的基因表达能否促进缺血后肢的血管新生过程,同时观察该突变体对FAK, PI3K/Akt/eNOS通路、ERK通路、Cdc42和Rac1通路的影响,通过上述研究结果进一步揭示CD151促血管新生的分子机制。 研究方法 1.构建pAAV-GFP、pAAV-CD151以及pAAV-CD151–QRD194-196→AAA质粒。扩增、提取、纯化质粒后,使用三质粒共转染法包装制备rAAV-GFP,rAAV-CD151和rAAV-CD151–AAA突变体病毒。病毒包装成功后通过斑点杂交法来检测我们所包装的病毒的滴度。 2.成年雄性Wistar大鼠30只（重200～250g）随机分为5组,每组6只,其中四组分别给于生理盐水, rAAV-GFP , rAAV-CD151和rAAV-CD151–AAA194–196（1.5×l011 pfu/只）分点注射至大鼠左侧后肢肌肉组织内,注射位点分别为:股四头肌（3点）、股内收肌（3点）、半膜肌（2点）,腓肠肌（2点）,每个注射位点100ul基因,转染1周后行股动脉切除术建立大鼠后肢缺血模型,假手术组施行相同的手术步骤但不切除股动脉。基因转染5周后测定后肢皮肤温度;免疫组化法检测缺血肌肉组织毛细血管密度;Western blot免疫印迹和免疫组化法检测各组大鼠缺血肢体局部CD151的表达;同时Western blot免疫印迹检测FAK、PI3K、Akt、eNOS、ERK、Rac1/Cdc42的表达情况,了解CD151- AAA突变体对FAK-MAPKs, FAK-PI3K和Rac1/Cdc42信号通路的影响。 实验结果 1.经过基因测序鉴定,成功构建了pAAV-CD151- AAA194-196突变体。斑点杂交法检测各包装病毒的滴度可以满足我们实验需要。 2.术后5周,CD151和CD151–AAA194–196组的CD151蛋白及AAA194–196突变体蛋白表达水平明显高于其余各组（P＜0.05）,CD151和CD151–AAA194–196组两组蛋白水平无明显差别,但CD151组大鼠缺血后肢平均皮肤温度和毛细血管密度明显高于CD151–AAA194–196组（P＜0.05）,同时CD151–AAA194–196组大鼠缺血后肢平均皮肤温度和毛细血管密度与生理盐水组和GFP组相比无明显差别,此外,Western blot的结果显示,CD151组磷磷酸化ERK,酸化FAK, PI3K,磷酸化Akt,磷酸化eNOS和磷酸化Rac1/cdc42的蛋白表达明显增加,显著高于其余各组。而CD151-AAA组上述细胞信号分子的表达没有明显增加。 实验结论 1.成功构建了pAAV-CD151- AAA194-196突变体并且包装成重组腺相关病毒。 2.研究证实CD151促血管新生是通过形成CD151-整合素α3/α6复合体而实现的,CD151-整合素α3/α6复合体的形成是CD151促血管新生的始动机制,CD151-整合素α3/α6复合体通过激活FAK-MAPKs, FAK-PI3K和Rac1/Cdc42等信号通路来实现调节血管新生的作用。 3. CD151胞外大环特异性位点QRD194-196在CD151与整合素α3/α6的结合过程中发挥了重要作用,是CD151胞外结构的一个重要基序。