论文部分内容阅读
[目的]新生儿缺血缺氧性脑病(Neonatal hypoxic ischemic encephalopathy,NHIE)是一种破坏性的神经系统性疾病,是新生儿死亡的主要原因之一。细胞色素c氧化酶5A(Cytochrome c oxidase subunit 5A,COX5A)是存在于线粒体呼吸链的一种代谢酶,其表达下调会导致线粒体能量失衡,从而影响神经系统疾病的发生发展。本研究旨在探讨COX5A在新生大鼠缺血缺氧(Hypoxic-ischemic,HI)性脑损伤中的作用,并进一步探讨COX5A发挥作用的相关分子,希望为HIE的治疗提供新的思路。[方法]体内实验:选择54只7日龄雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为HI和假手术组(Sham)。HI组采用电凝器凝断右侧颈总动脉作缺血处理,并暴露在缺氧箱内2h以达到缺氧的效果。Sham组仅暴露右侧颈总动脉不做电凝处理。通过Zea-Longa 评分和 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(Triphenyte-trazoliumchloride,TTC)染色对模型进行评价。然后用原位缺口末端标记(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,Tunel)染色检测HI后大脑右侧皮质细胞的凋亡情况。苏木素伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)观察右侧皮质损伤后的组织结构和细胞形态。免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色检测HI后右侧皮质神经元的变化。此外,实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,QRT-PCR)、免疫酶组织化学染色(Immnuohistochemistry,IHC)和蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)检测HI后大脑皮质中COX5A的mRNA和蛋白表达水平变化。体外实验:取新生24h内的SD大鼠的大脑皮质培养原代皮质神经元并构建氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)损伤模型,采用 QRT-PCR 和 IF检测COX5A在OGD后的mRNA和蛋白表达变化。在此基础上,构建HSV-COX5A过表达病毒,转染到皮质神经元中,通过beta Ⅲ Tubulin(Tuj 1)免疫荧光染色,测量神经元轴突长度和细胞胞体面积大小、计数神经元数量,以观察COX5A过表达后神经元的生长情况。利用Tunel染色以观察COX5A过表达后对神经元凋亡的影响。而且通过GeneMANIA预测与COX5A相互作用的分子:GDP 解离抑制因子α(Rho-guanine dissociation inhibitorα,Rho-GDIα)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase 2,Sod2)、谷胱甘肽 S-转移酶 1(Glutathione s-transferaspl,Gstp1)、磷酸丙糖异构酶(Triosephosephate isomerase,TPI),最后用QRT-PCR和WB技术检测其表达水平变化,来探讨参与COX5A作用于皮质神经元的相关分子。[结果]通过体内构建新生大鼠HI模型和体外皮质神经元的OGD模型,研究发现:体内实验:1、Zea-Longa评分显示:与Sham组相比,HI组大鼠在0h、2h、4h、8h、16h均会出现步态不稳,向前行走时偏向一侧的情况,且评分明显增高,能达到3分左右(P<0.05)。2、TTC染色显示:HI组的右侧皮质有明显的白色梗死灶,且定量分析显示HI组的大鼠脑梗死体积明显增多,且差异具有统计学意义(P<0.05);结合Zea-lonag评分和TTC染色结果证明模型构建成功。3、HE染色结果显示:Sham组细胞结构排列紧密,未见异常,HI组大鼠右皮质细胞排列紊乱,正常神经元减少,细胞核呈空泡状,核仁偶见消失。4、Tunel染色结果显示:与Sham组相比,HI组大鼠右侧皮质Tunel阳性细胞数增加,凋亡率明显增加(P<0.01)。5、IF染色结果显示:与Sham组相比,HI组中NEUN阳性细胞数在右侧皮质缺血区显著下降(P<0.05)。6、IHC、QRT-PCR、WB结果显示:与Sham组相比,HI损伤后,COX5A的表达在大脑右侧皮质明显下降(P<0.05)。7、HI损伤后,右侧皮质的COX5A的表达下降与神经元的降低呈正相关。体外实验:1、通过OGD处理的原代皮质神经元可模拟体内的HI模型,发现与正常组相比,OGD组的皮质神经元胞体较小,轴突之间的神经网络连接较为稀疏。2、QRT-PCR和IF染色结果显示,与Normal组相比,COX5A的表达水平在OGD组中明显下降(P<0.05)。3、在HSV-COX5A过表达病毒转染皮质神经元后,QRT-PCR结果显示在不管是正常还是OGD情况下,与阴性对照组(Negative control,NC)COX5A过表达组中COX5A的mRNA的表达水平显著增加(P<0.01),提示转染成功。4、为了研究COX5A过表达对神经元生长的影响,Tuj1染色结果显示,与Normal组相比,OGD组的神经元轴突长度和细胞数量明显减少(P<0.01),细胞胞体面积增加(P<0.05),提示OGD后神经元细胞出现肿胀。与阴性对照组(Negative control,NC)组相比,COX5A过表达组的神经元的轴突长度(P<0.01)、细胞数量(P<0.05)明显增加。5、为了研究COX5A过表达对神经元凋亡的影响,Tunel染色结果显示,与NC组相比,COX5A过表达后细胞凋亡数量减少,凋亡率明显下降(P<0.01)。6、通过GeneMANIA预测到与COX5A相互作用的分子,发现有:Gstp1、TPI、Rho GDIα和Sod2,发现Gstp1和TPI与COX5A共表达。QRT-PCR结果显示,Rho GDIα和 Sod2 的 mRNA 表达下降(P<0.05),Gstp1 和 TPI 的 mRNA 表达增加(P<0.05)。且TPI在OGD损伤后表达减少(P<0.05),与COX5A的表达一致。WB实验进一步验证TPI的蛋白表达水平,发现在OGD损伤后表达下降,但是COX5A过表达后,与NC相比,TPI的蛋白表达水平在COX5A过表达组中明显增加(P<0.05)。因此推测TPI分子可能是COX5A过表达后促进轴突再生和减少细胞凋亡的关键分子。[结论]新生大鼠HI损伤后,COX5A的表达降低导致神经元凋亡增加,而且COX5A表达降低与神经元减少呈正相关。COX5A过表达后显著促进神经元轴突生长和减少神经元凋亡,可能与TPI表达上调相关。