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Puroindoline蛋白（含PINA和PINB蛋白）是控制小麦籽粒硬度的主要蛋白,大量存在于成熟种子糊粉层和胚乳细胞中。PINA蛋白是PIN蛋白的主要构成成分,能够抑制许多植物病原菌生长,对细菌和真菌有明显的抑制作用。本研究通过PCR技术扩增了小麦中成熟的Pina基因,克隆连接上GST和HIS蛋白纯化标签,使重组载体在大肠杆菌中进行了高效表达。经纯化,获得了具有较高活性的重组PINA蛋白。以标准黄曲霉菌为测试菌株,综合运用流式细胞仪、荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜、激光共聚焦显微镜、蛋白质免疫印迹等多种检测手段,探究了重组PINA蛋白对黄曲霉菌的抑制作用。主要研究结果如下:（1）提取小麦（扬麦15）基因组DNA,通过PCR扩增得到了长度为363 bp的成熟Pina基因。用Not I和EcoR I分别酶切Pina与pGEX4T-3质粒,并用T4 DNA连接酶连接后转化至大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆,获得重组质粒pGEX4T-3+Pina。以重组质粒pGEX4T-3+Pina为模板,PCR扩增得到长度为1063 bp的GST-Pina基因。用Xho I和Hind III分别酶切GST-Pina和pET28A（+）质粒,再经酶连,获得重组质粒pET28A（+）+GST-Pina。将该重组质粒转入到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。检测发现,表达后的目的蛋白以包涵体的形式存在。包涵体蛋白经过变性、复性、Ni柱纯化,获得了重组PINA蛋白。对PINA蛋白进行抑菌活性检测,在PDB和DPY液体培养基中,128μg/mL的PINA蛋白能在24 h内完全抑制孢子萌发。在PDA固体培养基上,当蛋白浓度为42.4μg/mL时,抑制效果最好。在10 g玉米粉培养基中,当蛋白添加量为960μg时,抑菌作用最明显。（2）研究了PINA蛋白对黄曲霉孢子作用方式。扫描电镜观察发现,128μg/mL的PINA蛋白处理后孢子12 h后,孢子表面凹陷不平,部分孢子出现变形,甚至萎缩。处理24 h后,部分孢子出现破裂,并伴有疑似内容物流出;透射电镜观察发现孢子细胞壁有部分破损,模糊,细胞质壁分离,细胞器被破坏。PI染色显示孢子细胞膜受到了损伤;JC-1荧光探针标记表明,线粒体膜电位下降,暗示PINA蛋白对黄曲霉孢子的线粒体造成了损伤;DAPI染色发现细胞核损伤,细胞核呈弥散状,DNA发生断裂趋势明显。用含PINA蛋白的PDA培养基（终浓度为22μg/mL和40μg/mL）培养黄曲霉孢子48 h后,提取菌丝总RNA,反转录得到cDNA,采用RT-PCR技术对FKS1、ROT1、GEF1、TRK1、brlA和FPS1等相关基因进行表达量分析,结果表明brlA和FPS1下调表达,FKS1、ROT1、GEF1和TRK1基因上调表达。两个下调基因主要参与了孢子萌发（brlA）与细胞膜合成（FPS1）,大多数上调基因与细胞壁合成（FKS1和ROT1）和监测细胞膜相关蛋白有关（GEF1和TRK1）。研究PINA蛋白对黄曲霉菌丝的影响发现,扫描电镜下,用32μg/mL和64μg/mL的PINA蛋白处理菌丝12 h后,较对照处理组菌丝表面粗糙,褶皱弯曲。当蛋白浓度大于96μg/mL处理时,菌丝表面开始出现孔洞。PI,JC-1和DAPI染色表明,当处理蛋白浓度从32μg/mL、64μg/mL、96μg/mL到128μg/mL时,菌丝荧光强度不断增强,说明PINA蛋白能使菌丝细胞膜破裂、线粒体损伤、DNA断裂或移位。本研究初步探明了PINA蛋白对黄曲霉的作用方式,为耐储藏小麦的分子育种及新型储粮防霉剂开发奠定了基础。