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目的肿瘤细胞氧化压力的增高是导致线粒体和mt DNA病理改变的重要原因,但是活性氧自由基与mt DNA损伤及后续的生物学效应的关系还不清楚。本实验利用细胞一步法定量PCR新方法分析和比较外源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)诱发肿瘤细胞mt DNA损伤和修复、拷贝数变化和细胞毒性反应的异同及动态变化过程。方法选用口腔癌中发病率较高,恶性程度较强的口腔鳞状细胞癌SCC-25细胞株为实验模型,利用细胞一步法裂解和超螺旋敏感性定量PCR(ss-q PCR)的方法同时分析和比较外源ROS和RNS诱发肿瘤细胞mt DNA损伤的效应,论证两类不同活性自由基分子的异同。ROS以五个浓度H2O2(60-960μM),四个时间点(20 min,1 h,24 h,48 h)诱导细胞出现氧化损伤反应,RNS用林西多明(3-morpholino-sydnonimine,SIN-1)五个浓度(0.25-1 m M),四个时间点(1h,6 h,24 h,48 h)诱导细胞出现氧化损伤反应。通过ss-q PCR方法测定mt DNA损伤、修复的动态过程,细胞一步法微滴式数字PCR(dd PCR)方法用于测定细胞mt DNA拷贝数改变,MTT方法测定细胞活性与生长抑制,单细胞克隆实验测定10天细胞存活率。结果本研究建立了细胞一步法定量PCR分析技术,即细胞裂解后直接用于PCR,完全避免DNA的提取与纯化,从而可在96-孔板中进行高通量快速分析。我们用实验证明细胞一步法样本处理不仅可与ss-q PCR结合进行mt DNA损伤与修复的快速分析,而且可与dd PCR结合进行细胞内mt DNA拷贝数变化的绝对定量分析。利用细胞一步法ss-q PCR和dd PCR方法,本研究系统性分析了外源性H2O2诱发SCC-25口腔癌细胞mt DNA损伤、修复和拷贝数改变的动态变化过程,揭示出一个十分敏感的早期mt DNA损伤反应,一个区分可恢复性和不可逆性mt DNA损伤的阈值剂量;高剂量H2O2诱发的不可逆性mt DNA损伤是导致mt DNA拷贝数下降和细胞严重生长抑制和毒性的主要诱因之一,而mt DNA低剂量的可恢复性则与单细胞克隆的10天存活率相关。此外,我们首次证明外源性SIN-1(一个常用的过氧亚硝基阴离子(ONOO-)供体)可以在SCC-25细胞诱发一个早期剂量依赖性mt DNA损伤的增高,但是与H2O2不同,高剂量SIN-1诱发的不可逆损伤并不伴随mt DNA拷贝数的改变。表明SIN-1可能通过与H2O2不同的机制诱发mt DNA的损伤。结论本研究建立的细胞一步法ss-q PCR和dd PCR分析方法为mt DNA的损伤、修复和拷贝数变化的系统分析提供了一个强有力的新技术平台。本研究揭示了外源性H2O2可在SCC-25口腔癌细胞诱发一个十分独特的mt DNA损伤、修复和拷贝数改变的动态变化过程,早期mt DNA损伤的程度和类型决定或指示后续细胞急性毒性和慢性存活率的不同应答反应。我们首次证明SIN-1可以在SCC-25细胞诱发一个早期剂量依赖性mt DNA损伤的增高,但与H2O2的作用方式不同。表明SIN-1可能通过与H2O2不同的机制诱发mt DNA的损伤和细胞毒性。