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目的:1、探索低频电磁场（EMF）联合VEGF干预对大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）增殖、成骨成血管分化的影响及可能的分子机制。2、探究rBMSCs复合聚己内酯（PCL）/羟基磷灰石（HA）支架经EMF和VEGF联合干预后,PCL/HA支架上rBMSCs的活性和增殖情况。3、探究rBMSCs复合PCL/HA支架经EMF和VEGF联合干预后形成的组织工程骨EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA用于修复大鼠颅骨缺损的骨生成效果。方法:1、体外分离培养4周龄大鼠的骨髓间充质干细胞,并对大鼠骨髓间充质干细胞进行三系分化鉴定。取第三代大鼠间充质干细胞,经EMF（15Hz,1m T,4h/day）联合VEGF（50ng/ml）干预培养1-7天,观察细胞生长形态变化并使用CCK-8检测细胞的增殖情况。2、选用三代大鼠间充质干细胞,经EMF联合VEGF干预培养后,通过RT-PCR检测成骨相关基因OCN、RUNX2、COLI和成血管相关基因VEGFR2、v WF、CD31的表达,通过Western-blot检测成骨相关蛋白OPN、RUNX2、COLI和成血管相关蛋白VEGFR2、v WF、CD31以及Wnt通路相关蛋白的表达。3、将大鼠骨髓间充质干细胞经EMF联合VEGF干预培养后,以免疫荧光染色检测大鼠骨髓间充质干细胞成骨成血管的表达情况。4、采用3D打印技术将聚己内酯（PCL）和羟基磷灰石（HA）打印PCL/HA复合支架,将大鼠骨髓间充质干细胞接种在PCL/HA支架上,经EMF联合VEGF干预培养后,使用live-dead染色检验支架的细胞相容性,使用扫描电子显微镜（SEM）观察大鼠骨髓间充质干细胞在PCL/HA支架上的细胞形态和增殖情况。5、将rBMSCs接种在PCL/HA支架上,经EMF/VEGF干预培养形成组织工程骨EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA,并构建组织工程骨rBMSCs/PCL/HA、EMF/rBMSCs/PCL/HA、VEGF/rBMSCs/PCL/HA和PCL/HA,对比研究对大鼠颅骨缺损模型的修复程度。6、手术后4周和12周时,对各组动物进行micro-CT扫描、组织学免疫组化染色及组织学切片评估缺损部位骨生成及血管生成情况。在手术12周后进行薄片推出（push-out）实验检测骨缺损修复的力学效果。结果:1、大鼠股骨和胫骨骨髓中分离出的间充质干细胞可以在成骨、成软骨及成脂诱导基培养下进行三系分化。经VEGF以及EMF/VEGF干预的骨髓间充质干细胞呈现出类鹅卵石样形态。经CCK-8检测发现培养7天后经EMF或/和VEGF干预下的细胞增殖速度较快。2、EMF干预刺激能上调基因OCN、RUNX2、COLI和蛋白OPN、RUNX2、COLI、CD31的表达,VEGF干预刺激能上调VEGFR2、v WF、CD31基因和蛋白的表达,同时能轻微上调基因OCN、RUNX2和蛋白OPN、COLI的表达。EMF和VEGF干预刺激均显示了Wnt1、LRP-6和β-catenin的上调。3、免疫荧光染色显示EMF干预后细胞表面分子标记OCN阳性,VEGFR1阴性;相反的VEGF干预后细胞表面分子标记VEGFR1阳性,OCN阴性;共同刺激组均为阳性。4、PCL/HA支架细胞相容性良好,rBMSCs能够在支架上进行正常生长及增殖,经VEGF干预刺激后细胞增殖较快,形态上未见明显区别。5、动物手术后12周micro-CT扫描结果显示构建的EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组织工程骨新生的骨量增加最为明显。组织学免疫组化染色显示OPN表达量在EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组最高,CD34表达量在VEGF干预组中明显升高。HE和MASSON染色可以发现EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组支架部分的骨替换度较其余组明显增多,且有类似髓腔样结构出现。EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组及VEGF/rBMSCs/PCL/HA组骨缺损处新生血管最为显著。6、Push-out实验结果显示EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA组能够承受的最大压力及载荷最高。结论:1、获取的大鼠骨髓间充质干细胞具有分化的潜能。2、EMF能促进rBMSCs的成骨分化相关基因和蛋白的表达,VEGF能促进rBMSCs的成血管分化相关基因和蛋白的表达,且均是通过Wnt/β-catenin通路进行调控。3、PCL/HA支架细胞相容性良好,rBMSCs在EMF/VEGF干预下能在PCL/HA支架上增殖良好。4、组织工程骨EMF/VEGF/rBMSCs/PCL/HA具有良好的组织相容性,具有较强的促进骨缺损修复的作用,同时具有一定的促进血管生成的作用,用于骨缺损修复效果良好,构建方法简单、有效,具有一定的临床应用前景。