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慢性粒细胞白血病(CML)是发生于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤，占成年人白血病的20%，其年发病率约为1.6人/10万。CML经历慢性期、加速期、急变期三个阶段，未经治疗患者各阶段的中位数时间分别为4～5年、6～9个月和3～6个月。是一类严重威胁人类健康的血液系统恶性疾病。90%以上CML患者的血细胞中存在Ph染色体t(9，22)(q34，q11)。由于染色体易位形成了BCR-ABL融合基因，在CML细胞中以p210BCR-ABL最为常见。该融合蛋白不仅失去了c-ABL激酶中N-端Cap结构域对其自身活性的抑制作用，同时BCRN-端的coiled-coil结构域介导BCR-ABL形成同源二聚体或四聚体，进一步导致BCR-ABL的组成性磷酸化及蛋白酪氨酸激酶活性的过度活化。活化的BCR-ABL可通过募集下游分子而激活细胞内的多条信号通路，最终通过各种信号网络的激活而导致细胞过度增殖及凋亡抵抗。多项临床及实验研究均证明，过度活化的BCR-ABL融合基因不仅是CML的特征性标志，而且是CML发生、维持与发展的非常重要的原因。因此，BCR-ABL也是非常好的治疗靶标。泛素-蛋白酶体途径是近三十年来发现的一种细胞内蛋白质高效降解的新机制。此条通路依赖于ATP和泛素，能高度选择性地进行细胞内胞质和核蛋白质的降解，从而调控几乎所有的细胞活动。泛素化反应过程是在ATP参与下，泛素首先与泛素活化酶E1相结合而活化；接着，泛素从E1-泛素复合体被转移到泛素结合酶E2；在泛素连接酶E3的催化下，泛素最后以异肽键连接到靶蛋白。底物蛋白被带上泛素化的标签后，进而在蛋白酶体中被降解。其中E3是蛋白质降解过程中决定底物特异性的重要的酶。RING-E3s由于分子中含有RING催化结构域而得名，为连接酶中最大的家族；U-boxE3s分子结构中含有U-box。这两类E3s均不与泛素形成共价键，而是通过分子中的其他结构域直接或间接与底物结合后，催化泛素分子从E2-泛素复合物传递给底物，促使底物发生泛素化修饰与降解。本研究组通过设计和构建嵌合泛素连接酶，以实现靶向性结合、降解CML中的致癌性Bcr-Abl。在本研究的第一部分实验中，我们采用分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1（-）构建pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA3.1(-)-Bcr-AblT315I的真核表达载体，并且转染HEK-293T细胞后证实其能够正确表达，为后续研究奠定了基础。在第二部分实验中，我们检测了嵌合泛素连接酶在K562肿瘤细胞系和HEK-293T细胞系中对靶蛋白的降解作用。第三部分，通过细胞学实验观察嵌合泛素连接酶对K562细胞的增殖抑制和促进凋亡作用。实验一：分别设计引物，通过分段PCR将BCR-ABL分3个片段依次亚克隆入pcDNA3.1（-）。以包含BCR-ABL融合基因全长的pGD210质粒为模板，首先通过PCR分别扩增出Bcr-a片段和Abl-c片段，依次克隆入pcDNA3.1(-)的NheI/XhoI之间和KpnI/HindIII之间，最后XhoI/KpnI双酶切pGD210，将酶切获得的中间片段插入已包含Bcr-a和Abl-c的pcDNA3.1(-)的XhoI/KpnI位点之间，构建为pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl。酶切鉴定及测序正确后，转染293T细胞，Westernblot验证质粒的表达。接着以pcDNA3.1(-)-BCR-ABL为模板，设计定点突变引物，采用重组PCR方法获得315位氨基酸T突变为I(T3151)的片段，置换相应野生型片段，构建pcDNA3.1(-)-Bcr-AblT315I突变质粒真核表达载体。实验二：将嵌合泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV-SH2-U或其对照pFLAG-CMV-SH2（来自生化教研室）电击转染入K562细胞，或者将构建成功的pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl/pcDNA3.1(-)-Bcr-AblT315I真核表达载体与嵌合泛素连接酶以脂质体共转染入HEK-293T细胞，证实泛素连接酶促进靶蛋白Bcr-Abl降解的作用。研究发现不仅是在内源性高表达靶蛋白的K562中还是在非内源性表达的HEK-293T细胞中，嵌合泛素连接酶都具有下调靶蛋白Bcr-Abl水平的作用。利用Real-timePCR实验进一步证实Bcr-Abl蛋白水平的变化是发生在翻译后水平。实验三：将嵌合泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV-SH2-U或其对照pFLAG-CMV-SH2电击转染K562细胞，采用MTT实验测定细胞的增殖、流式细胞仪测定细胞凋亡。结果证实嵌合泛素连接酶可有效抑制K562肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡综上所述，慢性粒细胞白血病肿瘤细胞中有过度活化的Bcr-Abl融合蛋白，利用成功设计的能够靶向降解BCR-ABL及耐药突变体的嵌合泛素连接酶，实现在慢粒肿瘤细胞内靶向性降低/去除这些致癌蛋白的作用，从而为CML治疗提供一种新方法。