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背景:牙周炎是以牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收为主要特征的一种常见的口腔慢性免疫炎症性疾病,其患病率高达80%~90%,是我国成人丧失牙齿的主要原因之一。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)作为牙周炎的主要致病菌,在其侵袭牙周组织后能够诱导大量吞噬细胞聚集,引起炎症反应的发生,进而导致牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收。Pg菌定植牙周组织后释放一种环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)的物质,其通常存在于革兰氏阴性菌中,充当于细菌的第二信使,能够将受体信号从细胞表面转移到真核细胞的细胞质或细胞核中的一种靶分子。它是细胞信号转导级联的一部分,能够将初始信号扩增数倍从而对细胞内的生化反应产生巨大作用。在牙周组织破坏的过程中,免疫炎症反应发挥着重要作用,作为机体固有免疫系统的重要组成部分——巨噬细胞,势必参与其中。在促炎或抗炎的微环境下,巨噬细胞可分化为两种不同类型,即M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞,此过程称为巨噬细胞极化。巨噬细胞的极化过程在对机体抵抗病原体感染及组织的修复过程中发挥重要作用。因此,推测c-di-GMP可通过调控巨噬细胞极化,分泌炎症因子及骨吸收因子,进而导致牙周炎症的发生。方法:拟应用不同浓度梯度的c-di-GMP(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、50μg/m L)刺激处于对数生长期的RAW264.7细胞不同时间(3h、6h、12h、24h)后,进行下列各种检测:1.光学显微镜观察c-di-GMP对巨噬细胞生长形态的影响;2.提取细胞样本总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及巨噬细胞极化相关细胞因子IL-23、i NOS、IL-10的m RNA表达水平;3.收集细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定上述细胞因子的蛋白分泌量;4.通过流式细胞术(FCM)检测M1型巨噬细胞表面标志分子F4/80、CD86和CD206的表达情况。结果:1.RAW264.7细胞系与c-di-GMP共同培养24小时后光学显微镜下观察到阴性对照组(即c-di-GMP浓度为0μg/m L)细胞形态以类圆形为主,伴有不规则多边形,少量细胞有伪足;而受到c-di-GMP刺激的细胞呈长梭形,伸出大量伪足,并且细胞铺展面积明显增大。2.不同浓度(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、50μg/m L)的c-di-GMP与RAW264.7细胞共培养24小时后,观察到炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和M1型巨噬细胞极化相关细胞因子IL-23、i NOS的m RNA表达水平随着各组c-di-GMP的浓度增加而逐渐依次增高,并具有剂量依赖性。M2型巨噬细胞极化相关细胞因子IL-10的m RNA表达水平在各个浓度组中的表达水平无显著升高。确定共培养最佳浓度(50μg/m L)并采用此浓度的c-di-GMP分别刺激RAW264.7细胞3、6、12、24 h后,检测到炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α和M1型巨噬细胞极化相关细胞因子IL-23和i NOS的m RNA表达水平在各个时间组均有增高,具有时间依赖性,不同细胞因子基因的表达高峰时间略有差异。而M2型巨噬细胞极化相关细胞因子IL-10的m RNA表达水平在各时间组中的表达水平无显著升高,无统计学意义。3.在不同浓度c-di-GMP与RAW 264.7细胞共培养不同时间后,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和巨噬细胞极化相关细胞因子IL-23、NO和IL-10的蛋白分泌量与各自的m RNA表达水平基本相一致:炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和M1型巨噬细胞极化相关细胞因子IL-23、NO的蛋白分泌水平随着各组c-di-GMP的浓度、时间的增加而逐渐依次增高,具有剂量、时间依赖性;M2型巨噬细胞极化相关细胞因子IL-10的蛋白分泌水平在各浓度组、各时间点的分泌量基本相同,差异无统计学意义。4.流式细胞术结果表明:MDEM高糖培养基培养的RAW264.7细胞表面F4/80的阳性表达率96.67%,此外M1型巨噬细胞的表面标志物CD86和M2型巨噬细胞的表面标志物CD206与其相应的同型对照组相比阳性率均有显著差别,故本实验应用RAW264.7细胞可证明为未分化的巨噬细胞即M0状态的巨噬细胞。高浓度组(50μg/m L)c-di-GMP即高浓度组分别与RAW 264.7细胞共培养24小时后,与阴性对照组相比RAW 264.7细胞表面标志物CD86的单阳性率由78.42%升至93.66%,差异具有统计学意义。C-di-GMP低浓度组(5μg/m L)结果与阴性对照组相比,无显著差异,但存在增高趋势。结论:1.C-di-GMP能够刺激巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α等牙周炎代表性的炎症因子。2.C-di-GMP可诱导巨噬细胞发生M1型巨噬细胞极化,分泌M1型巨噬细胞极化相关细胞因子IL-23、i NOS和表面标志物CD86。