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顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase)是一种环氧化物水解酶(sEHs, EC 3.3.2.10)。其功能是不借助辅因子或金属离子催化环氧琥珀酸的环氧键的水解,形成特定手性的酒石酸。本文研究的顺式环氧琥珀酸水解酶催化产生L(+)-酒石酸。此类cis-epoxysuccinate hydrolase (CESH)存在于多种微生物体内,如根瘤菌(Rhizobium)、假单胞菌(Pseudomonas)、诺卡式菌(Nocardia)、棒状杆菌(Corynebacterium)和红球菌(Rhodococcus)。CESH在工业上得到了应用,其优点在于催化效率高,立体选择性好。但目前工业生产所用的CESH自身的稳定性差,催化剂的使用寿命较短,提高CESH的稳定性可以进一步提高工业生产的效率。本研究选取目前工业生产所使用的来自红球菌(Rhodococcus)顷式环氧琥珀酸水解酶,经过密码子优化后合成该基因(GenBank DQ471957),构建重组质粒pET8a(+)-CESH;转入宿主菌E. coli BL21(DE3),构建工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CESH;使用IPTG诱导表达,分析其活性及热稳定性。野生型CESH的比活力为76.5 U/mg,其50℃下的半衰期(t1/2,50℃)为8.5 mmin,其T5015(酶在该温度下15 mmin内丧失50%活力)为44.0℃。设计了针对该酶热稳定性的高通量筛选方法,优化了易错PCR的反应条件。经定向进化改造,得到一株突变体1X-1(Q122R),比活力为75.8 U/mg,t1/2,50℃为31.6 min,T5015为49.5℃。在此基础上,以突变体1X-1为母本进行进一步的定向进化改造,均未能得到更好的突变体有益突变,改造受阻。因此,研究转向选择半理性设计思路对CESH进行进一步的改造。以突变体1X-1为母本,利用“多重序列对比”手段预测可能对蛋白质热稳定性有利的氨基酸替换方式,得到两株热稳定性较高的突变子,2X-2(Q122R,F26V)釉2X-4(Q122R, I83R)。突变体2X-2的比活力为76.1 U/mg,t1/2,50℃为162.1 min, T5015为54.6℃。突变体2X-4的比活力为74.3 U/mg, t1/2,50℃为44.0 min,T5015为50.4℃。利用定点突变将突变体2X-2和2X-4的突变位点结合在一起,得到突变体3X (Q122R,F26V, I83R),其比活力为75.5 U/mg,t1/2,50℃为170.8 min, T5015为55.4℃。以突变体3X为母本,利用“计算机模拟突变”预测能提高其热稳定性的氨基酸替换方式,得到了具有更高热稳定性的两株突变体,4X-4 (Q122R, F26V, I83R, D8K)和4X-6 (Q122R, F26V, I83R, S90R)。突变体4X-1的比活力为75.8 U/mg,t1/2,50℃为225.2 min,死015为61.6℃。突变体4X-6的比活力为75.2 U/mg, t1/2,50℃为180.5 min, T5015为56.5℃。将突变体4X-1和4X-6的突变位点结合在一起,得到了突变体5X (Q122R, F26V, I83R,D8K, S90R),其比活力为74.3 U/mg, t1/2,50℃为237.1 min, T5015为62.4℃。以突变体5X为母本,在其8位点,26位点,83位点,90位点和122位点上分别进行定点饱和突变,筛选出一株带有更高热稳定性的突变体5X-1 (Q122R, F26W, I83R, D8K, S90R),其比活力为75.1 U/mg, t1/2, 50℃为293.2 min,T5015为64.8℃。相较于野生型CESH,突变体5X-1的催化效率没有明显下降,并且具有极高的热稳定性和酸碱耐受性。突变体5X-1在50℃下酶活力的半衰期提高了33.5倍,T5015则提高了20℃；最适pH值范围则由野生型的8.0-9.0扩展到了5.0-10.0,大大提高了酶的pH值耐受性。另外,将突变体5X-1固定化后所得的生物催化剂的活力较固定化野生酶提高了一倍；并且固定化野生型CESH在37℃,45℃和50℃下的半衰期分别是13天,5天和2天,而固定化突变子5X-1的半衰期在50℃和45℃下分别为25天和35天,在37℃下反应38天后仍残余65%的活力,使用寿命得到了极大的延长。