论文部分内容阅读
补体调节因子I(CFI)是哺乳动物补体系统的重要组成成分,发挥着免疫调节的作用,在辅因子C4bp、MCP和CFH的作用下通过酶解C3b和C4b分子调节补体系统的过度激活。已有研究表明哺乳动物中CFI有重要作用,且与疾病发生相关,但CFI在其它物种中研究较少。斑马鱼作为一种重要的模式动物,其基因组测序已经完成,与人类基因的保守性高达85%,这使得斑马鱼适于研究基因的表达与功能。本论文成功从斑马鱼中克隆了补体因子CFI,并分析了其特征、表达,对功能进行了初步探索,同时对CFI的辅因子CFH在胚胎发育中的表达模式及其对LPS和LTA感染的应答进行了分析。斑马鱼CFI mRNA全长为2384bp,其中编码区为2193bp,编码含731个氨基酸的蛋白质,多肽链的分子量为81.4kDa,等电点pI为6.17。与其它脊椎动物CFI蛋白的同源比对结果显示序列相似性高达35.5%-67.1%,且序列中存在大量保守的半胱氨酸。CFI蛋白具有一段由18个氨基酸组成的信号肽和5个保守域,即FIMAC、SRCR、LDLr1、LDLr2和SP结构域。在信号肽与FIMAC结构域之间还有一段特异性的序列,这段序列可能是鱼类所特有的。成熟的CFI是由重链和轻链组成的异质二聚体,FIMAC、SRCR、LDLr1和LDLr2组成重链,SP结构域组成轻链,在轻链中存在保守的催化三联体His-Asp-Ser和一个位于催化部位底部的Asp残基。作为一种分泌型糖蛋白,斑马鱼的CFI序列中含有O-糖基化位点和N-糖基化位点,O-糖基化位点主要位于信号肽和FIMAC结构域之间的特异性序列区域,N-糖基化位点则分散存在于整个CFI序列之中。蛋白结构预测显示斑马鱼CFI蛋白同人CFI蛋白的空间结构具有很高的相似性,这预示它们功能上的相似性。进化分析显示,CFI蛋白在进化上高度保守,哺乳动物CFI基因聚为一枝,斑马鱼与硬骨鱼的CFI蛋白聚为一枝。LDLr1结构域和LDLr2结构域的进化树中两个结构域各聚为一簇,在每一个结构域的分枝中表现出与CFI蛋白全长进化树相同的聚类趋势。实时定量PCR检测结果显示斑马鱼CFI基因在各组织中广泛表达,其中在卵巢、精巢、肝脏、脑、肠和眼中的表达量很高。当受到LPS感染时,CFI在肝脏中的表达量上调。CFI基因和CFH家族基因在不同发育时期胚胎中具有不同的表达模式,CFI基因在胚胎发育的体节期表达量最多,而大部分CFH家族成员在1dpf胚胎中表达量开始显著增多,其中CFHL4在胚胎发育整个过程中都具有很高的表达量。在体节期,当胚胎受到LPS和LTA感染时,CFI基因的表达量显著下调,而CFH家族基因在胚胎发育不同时期则呈现不同的应答趋势,且表达量变化显著。推测CFH家族基因在斑马鱼胚胎发育过程中,通过多种形式对补体途径进行着精确的调控。胚胎整体原位杂交结果显示,CFI基因在胚胎发育的过程中在卵黄合胞体上一直具有特异性表达,在体节期时信号最强。当胚胎发育至1天时,CFI基因在松果体中也出现特异性表达。这提示CFI除了参与补体调节外,可能在早期发育过程中也起重要作用。初步实验表明过表达CFI mRNA并没有可见的对胚胎发育的影响。同时,还尝试了原核表达CFI,体外诱导表达重组蛋白CFI的大小为64.2kDa,这为进一步在蛋白水平研究斑马鱼CFI的功能奠定了基础。