胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤,且世界上近一半的新发胃癌位于我国。胃癌以高度侵袭性和易远处转移为特征,死亡率在我国所有恶性肿瘤中位列第三,但其侵袭转移的具体机制仍远不清楚。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)可以使肿瘤细胞获得侵袭转移的能力,是肿瘤转移的开端,但其分子基础仍有待深入研究。近年来,高通量测序技术促进了我们对肿瘤分子特征的认识,也为EMT的研究带来新的契机。胃癌的高通量测序研究揭示了以高侵袭转移性为特征的间质样胃癌即EMT分子亚型的存在。为了进一步认识胃癌EMT的具体分子机制,本课题利用公共数据库研究了间质样胃癌相关的基因表达谱,并通过生信方法筛选出了胃癌EMT的潜在关键基因TNS1。我们提出TNS1通过激活EMT上游关键驱动基因从而促进胃癌EMT及侵袭转移,且影响胃癌患者预后的科学假说,并通过细胞功能实验、机制研究及临床关联研究予以验证。本课题初步揭示了 TNS1在胃癌侵袭转移中的作用和机制,为抑制胃癌侵袭转移提供了理论依据和潜在的治疗靶点,有利于胃癌精准治疗的发展。第一部分 间质样胃癌的分子特征及EMT关键基因筛选研究背景:根据亚洲癌症研究组(Asian Cancer Research Group,ACRG)的分子分型,胃癌可分为间质样、微卫星不稳定、TP53活化及TP53失活型四种分子亚型。其中,间质样胃癌与EMT基因标签显著相关,同时CDH1基因表达显著减少,提示EMT是其主要特征。间质样胃癌的基因表达谱特征仍有待进一步研究,从中可以找到影响EMT发生发展的关键基因。目的:通过研究间质样胃癌的基因表达谱特征,筛选EMT关键基因,为进一步研究EMT的具体分子机制提供潜在靶点。方法:针对ACRG胃癌队列中的间质样胃癌和上皮样(除外微卫星不稳定型,包括TP53活化和TP53失活型)胃癌,进行基因表达的比对研究。通过基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)对差异表达基因行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路和基因本体论(Gene Ontology,GO)注释。通过加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)筛选与间质样胃癌关系最密切的基因。结果:在46例间质样胃癌和186例上皮样胃癌之间,显著差异表达(调整的p<0.05)基因共9712个。GSEA显示,与EMT、细胞-基质及细胞-细胞间交互作用等相关的KEGG信号通路及GO词条在间质样胃癌中被显著富集,提示相关基因的上调;而与细胞周期、DNA复制、DNA修复及细胞分裂等相关的KEGG信号通路及GO词条在上皮样胃癌中被显著富集,提示相关基因在EMT过程中可能下调。间质样和上皮样胃癌两组间表达量比值对数值(logFC)大于1的显著差异表达基因共1230个。WGCNA将这些基因分为3种颜色的模块,我们关注与间质样胃癌正相关的蓝绿色模块,模块内基因与间质样胃癌呈现高度的正相关(Spearman R=0.83;p<0.001)。通过对基因的功能关联程度评分并排序,我们从中筛选出了最为核心的30个基因。其中,TNS1基因与胃癌EMT的关系尚未报道。结论:肿瘤侵袭转移相关的基因在间质样胃癌中显著富集,其中TNS1是潜在的EMT关键基因。第二部分 胃癌EMT候选关键基因TNS1的验证研究背景:EMT是恶性肿瘤细胞获得侵袭转移能力的关键,其具体分子机制仍不完全清楚。TNS1属于紧张素粘着家族,在细胞粘附、运动及信号转导等方面有重要生理功能。研究发现TNS1参与了恶性肿瘤的侵袭转移,但其具体作用可能依赖于肿瘤类型,例如在乳腺癌和前列腺癌细胞中TNS1抑制侵袭转移,而在肠癌、膀胱癌及肺癌细胞中TNS1则促进侵袭转移。TNS1与胃癌侵袭转移的关系仍未见报道,且TNS1影响肿瘤侵袭转移的具体机制仍不清楚,本课题在第一部分发现TNS1是潜在的EMT关键基因,有待实验证实。目的:通过细胞功能实验、机制研究及临床验证,证实TNS1通过促进EMT而促进胃癌侵袭转移。方法:用siRNA构建TNS1敲减的胃癌细胞系SGC-7901和HGC-27。细胞划痕及Transwell细胞迁移和侵袭实验研究TNS1对胃癌细胞迁移和侵袭性的影响。利用公共数据库的胃癌mRNA和蛋白表达数据,通过参数基因集富集分析(Parametric Gene Set Enrichment Analysis,PGSEA)行 EMT 基因标签评分(gene signature),分析TNS1表达与EMT基因标签评分的相关性。qRT-PCR及WB实验研究TNS1敲减对EMT的上游关键驱动分子snail及间质细胞分子标志vimentin表达的影响。免疫组化染色TNS1蛋白,在江苏大学附属医院(Affiliated Hospital of Jiangsu University,AHJU)胃癌队列中分析TNS1蛋白表达水平与远处转移即M1分期的关系。利用胃癌队列ACRG和GE015459的转录组数据分析TNS1 mRNA表达水平与M1分期的关系。结果:TNS1敲减显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭(p<0.05)。TNS1 mRNA和蛋白表达与EMT基因标签评分均呈正相关,且TNS1敲减显著下调snail及vimentin的mRNA和蛋白表达(p<0.05),提示TNS1促进EMT。在AHJU胃癌队列中,M1的比例为9.6%,TNS1蛋白高表达者M1比例显著高于低表达者(12%vs 3.2%,p=0.045)。在ACRG和GE015459队列中,M1的比例分别为25.7%和31.3%,TNS1 mRNA高表达者M1比例均显著高于低表达者(36.3%vs 19.3%,p=0.001;36.7%vs 22.2%,p=0.037)。结论:TNS1通过促进EMT而促进胃癌侵袭转移。第三部分TNS1与胃癌临床病理特征及预后的关系研究背景:胃癌具有高度异质性,同一分期的患者也可能有迥异的预后,提示分子异质性的存在。寻找胃癌预后相关的分子标志有利于早期识别术后高复发转移风险的患者,有助于优化治疗策略。本课题在第一和第二部分的研究已初步证实TNS1与胃癌EMT及侵袭转移有关,但TNS1与胃癌临床病理特征及预后的关系仍有待研究。目的:通过分析TNS1与胃癌临床病理特征及预后的关系,揭示TNS1的临床意义。方法:在AHJU、ACRG和GE015459三个独立的胃癌队列中分析TNS1蛋白/mRNA表达水平与临床病理特征的关系,Kaplan-Meier生存分析联合Log-rank检验研究TNS1高表达对总生存期(overall survival,OS)的影响,单因素和多因素Cox风险比例模型分析影响OS的因素。结果:同时在至少两个胃癌队列中,神经侵犯阳性者的TNS1高表达率显著高于神经侵犯阴性者(p<0.05),Ⅲ/Ⅳ期胃癌的TNS1高表达率显著高于ⅠB/Ⅱ期(p<0.05),弥漫型胃癌的TNS1高表达率显著高于肠型(p<0.05)。在AHJU胃癌队列中,TNS1蛋白高表达者的OS较低表达者显著缩短(p<0.001)。在ACRG和GE015459胃癌队列中,TNS1 mRNA高表达者的OS较低表达者也显著缩短(p<0.001和p=0.008)。在对变量进行单因素Cox模型筛选后,多因素Cox模型表明TNS1表达水平在所有三个胃癌队列中均为独立的OS预测因素。结论:TNS1高表达提示不良预后,可作为预后预测因素。