【摘 要】
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目的:双酚A（Bisphenol A,BPA）是一种常见的环境内分泌干扰物,用于合成聚碳酸酯塑料和环氧树脂。研究发现孕哺期BPA暴露导致子代大鼠股骨、尾椎长度下降、生长板软骨厚度降低、骨骼矿化率下降等。然而,关于孕哺期BPA暴露对子代大鼠长骨软骨内成骨过程的影响及相关机制尚未见报道。我们采用饮水染毒的方式对妊娠期和哺乳期母鼠进行BPA染毒,观察孕哺期BPA暴露对子代大鼠生长板软骨细胞增殖、分化、终
【基金项目】
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辽宁省教育厅科学研究项目（JCZR2020019）；
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目的:双酚A（Bisphenol A,BPA）是一种常见的环境内分泌干扰物,用于合成聚碳酸酯塑料和环氧树脂。研究发现孕哺期BPA暴露导致子代大鼠股骨、尾椎长度下降、生长板软骨厚度降低、骨骼矿化率下降等。然而,关于孕哺期BPA暴露对子代大鼠长骨软骨内成骨过程的影响及相关机制尚未见报道。我们采用饮水染毒的方式对妊娠期和哺乳期母鼠进行BPA染毒,观察孕哺期BPA暴露对子代大鼠生长板软骨细胞增殖、分化、终末分化、凋亡和破骨细胞生成等软骨内成骨过程标志物表达的变化,探究孕哺期BPA暴露对子代大鼠软骨内成骨过程的影响。采用免疫组化染色检测Wnt/β-catenin信号通路下游效应蛋白β-catenin及其负反馈调节因子CXXC5的表达,探究孕哺期BPA暴露对Wnt/β-catenin信号通路的影响,为孕哺期BPA暴露与软骨内成骨过程、Wnt/β-catenin信号通路之间的关系研究提供进一步的数据支持。实验方法:8周龄Wistar大鼠,雌雄各18只,在适应性喂养1周后,将大鼠按照雌雄比1:1的比例每晚7时合笼,次日清晨检测是否有阴栓生成,发现阴栓记为妊娠第0天（GD 0）。孕鼠随机分为3组,对照组（饮用含0.01%无水乙醇的蒸馏水）,0.01mg/L BPA组,0.1mg/L BPA组。母鼠从GD 0到子代大鼠出生后第21天（PND21）,经饮水的方式进行染毒。各组子代大鼠断乳后均饮用蒸馏水。子代大鼠4周和8周龄时,测其体重,麻醉后测体长、尾长,剥离出左侧胫骨、股骨,用游标卡尺测量其长度。左侧胫骨经多聚甲醛固定、15%EDTA脱钙、梯度酒精脱水,石蜡包埋,制备5μm切片。HE染色观察胫骨生长板软骨细胞形态,Image J软件测量生长板静息区、增殖区和肥大区厚度;VG/Alcian双染观察次级骨化中心及骨小梁发育情况;免疫组化染色检测软骨细胞增殖标志物（PCNA、Col2a1）、分化标志物（Col10a1）和终末分化标志物（MMP13、OPN）的表达情况;TUNEL染色检测软骨细胞凋亡;TRAP免疫组化染色检测破骨细胞生成,RANKL、OPG免疫组化染色检测孕哺期BPA暴露对子代大鼠RANKL/OPG信号通路的影响;免疫组化染色检测Wnt/β-catenin信号通路下游效应蛋白β-catenin的表达,以及负反馈调节因子CXXC5的表达,探究孕哺期BPA暴露对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、孕哺期BPA暴露对子代大鼠体重、体长的影响:与对照组相比,孕哺期BPA暴露组子代大鼠胫骨、股骨、尾椎长度显著下降,4周改变较8周明显（P<0.05）。2、孕哺期BPA暴露对子代大鼠骨组织形态的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代雌鼠生长板厚度、增殖区和肥大区厚度均明显降低（P<0.05）,生长板软骨细胞排列紊乱,软骨细胞柱之间距离增加。BPA暴露组子代雄鼠仅在4周龄时生长板厚度略低于对照组（P<0.05）,其余各指标与对照组相比,差异均无统计学意义。与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠次级骨化中心明显变小、骨小梁变细变短,4周改变较8周明显。3、孕哺期BPA暴露对子代大鼠生长板软骨细胞增殖、分化的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠生长板软骨增殖标志物（PCNA、Col2a1）,肥大分化标志物（Col10a1）表达均明显下降（P<0.05）。4、孕哺期BPA暴露对子代大鼠生长板软骨细胞终末分化的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠生长板软骨终末分化标志物（MMP13、OPN）表达明显上升（P<0.05）。5、孕哺期BPA暴露对子代大鼠生长板软骨细胞凋亡的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠生长板软骨细胞凋亡率明显增加（P<0.05）。6、孕哺期BPA暴露对子代大鼠破骨细胞生成的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠TRAP阳性表达数明显下降（P<0.05）,进一步检测与破骨细胞生成有关的RANKL/OPG信号通路发现,与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠RANKL表达无明显变化,OPG表达显著增加,从而导致BPA暴露组子代大鼠RANKL/OPG比值下降（P<0.05）。7、孕哺期BPA暴露对Wnt/β-catenin信号通路的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠β-catenin的表达明显下降,而CXXC5表达明显上升（P<0.05）。结论:1、孕哺期BPA暴露可使子代雌鼠生长板厚度降低。2、孕哺期BPA暴露可抑制子代大鼠软骨细胞增殖、分化,促进终末分化和凋亡,并通过下调RANKL/OPG信号通路抑制破骨细胞生成,进而影响软骨内成骨过程。3、孕哺期BPA暴露可能通过激活CXXC5的表达下调Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制软骨内成骨。
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