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研究背景和目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）作为肝癌标志物，可反映肿瘤负荷，有助于部分肝癌诊断和疗效监测，但对于预后预测几无作用。尽管已报道的其他标志物越来越多，但其临床应用价值或者有限，或者需要广泛验证。因此，进一步鉴定能判断肝癌转移及预后的分子标志物，发展能准确预测肝癌复发转移和预后的检测手段仍是肝癌研究领域的一个重要课题。中期因子（midkine，MK）是一种肝素结合因子，在包括肝癌在内的多种类型恶性肿瘤中高表达。它直接参与肿瘤的生长、转移过程，在多种恶性肿瘤中高表达，有望成为一个新的肿瘤标志物。上皮-间质转化（epithilial-mesenchymaltransition，EMT）是上皮细胞失去极性转变成具有活动性的间质细胞的过程。现有的研究表明，EMT程序激活使肿瘤细胞获得异常活动能力，从而诱导肿瘤进展、侵袭、扩散，最终形成转移。本研究首先建立检测MK的肝素-ELISA方法，通过多种方法学分析以及临床肝癌标本检测，评价该方法的可行性，并将相同方法学原理用于MK和PTN（pleiotrophin，多向因子，与MK组成一个肝素结合生长因子家族）双因子总量的初步检测，为后续建立肝素结合分子群总量检测方法积累实验经验和工作基础。然后通过体外细胞研究和临床标本检测，建立MK诱导肝癌细胞EMT的实验证据，初步探讨MK通过诱导肝癌细胞EMT促进肝癌进展和转移的生物学作用。研究方法1.应用肝素-抗体双夹心原理建立检测MK的ELISA法，进行方法学研究。（1）基于MK对肝素的高亲和力，应用肝素-抗体双夹心原理建立检测MK的ELISA法。（2）绘制标准曲线。（3）分析灵敏度试验。（4）回收试验。（5）线性评价。（6）精密度试验。（7）方法学比较。2.应用肝素-双抗体夹心法检测MK和PTN双细胞因子总量的初步研究。3.肝癌血清MK含量检测。4. MK诱导EMT促进肝癌细胞增殖、侵袭的体外实验研究。（1）细胞增殖试验。（2）细胞侵袭试验。（3）细胞免疫荧光试验。（4）Western blot分析。5.临床肝癌标本MK、EMT分子标志物和循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）检测，以及这些指标之间的相关性分析。（1）免疫组织化学检测肝癌组织中MK表达。（2）免疫组织化学检测肝癌组织中E-钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）表达。（3）肝癌血液CTCs检测。（4）肝癌组织MK表达与肝癌血清MK含量、肝癌组织E-cadherin表达、肝癌血液CTCs含量以及肝癌临床病理学特征之间的相关性分析。实验结果1.建立了检测MK含量的肝素-抗体ELISA法，基本符合实验要求。（1）生物素化肝素与MK单克隆抗体的最佳工作浓度分别为2μg/mL和0.75μg/mL。（2）以各浓度的OD450为纵坐标，相应的浓度为横坐标，得出标准曲线方程为y=1.2308x-0.0094，r=0.9973。（3）分析灵敏度为0.047ng/mL。（4）MK回收率范围为90.6~102.0%，平均为96.85±4.04%。（5）MK浓度在0.096~1.436ng/mL范围内线性良好，得到的线性方程为y=1.1387x+0.011，r=0.998。（6）批内和批间变异系数（CV）分别为6.3~6.9%和9.0~9.8%。（7）与商品化人MK ELISA试剂盒（双抗体夹心法）的检测结果比较，二者之间的差异无显著性（P=0.058）。线性回归分析结果表明，二者之间的相关性良好（r=0.9779）。2. MK和PTN双细胞因子总量检测的初步结果显示，应用肝素-双抗体夹心法可检测2个肝素结合性细胞因子总量。3.临床血清检测结果显示，20例正常人血清MK含量为（0.259±0.061）ng/mL，85例肝癌血清MK含量为（0.501±0.111）ng/mL，二者之间有显著差异（P<0.05）。如果将0.382ng/mL设定为阳性界限，肝癌患者阳性率为85.9%。4. MK诱导肝癌细胞EMT的体外试验结果显示，（1）10nM MK刺激培养的肝癌细胞可获得最高的增殖力和最强的侵袭力；（2）MK刺激的肝癌细胞发生了典型的EMT细胞形态学改变，细胞中vimentin表达上调，E-cadherin表达下调。5.临床肝癌标本检测结果表明：（1）肝癌组织表达MK高于配对癌旁组织；（2）肝癌血清MK表达与配对肝癌组织MK含量正相关；（3）肝癌组织MK表达与TNM分期、肝内转移有关（P<0.05）；（4）肝癌组织中存在vimentin表达上调，E-cadherin表达下调的现象。肝癌组织MK表达与E-cadherin表达负相关（P<0.05）；（5）80%肝癌患者外周血可检出CTCs，检出数为12.6±13.2。肝癌组织MK表达与肝癌CTCs正相关。结论建立了检测MK含量的肝素-抗体ELISA法，基本符合实验要求；应用肝素-双抗体夹心的ELISA法可同时检测2个肝素结合性细胞因子总量。MK可诱导培养的肝癌细胞发生典型的EMT表型，刺激肝癌细胞增殖和侵袭；肝癌血清和组织高表达MK，并且与肝癌组织E-cadherin表达负相关，与TNM分期、肝内转移和CTCs正相关。因此，MK可能通过诱导EMT促进肝癌细胞肝内转移和血液播散。