人巨细胞病毒(HCMV)属疱疹病毒科,β疱疹病毒亚科,是感染人类最常见的病原体之一。该病毒在人体内可持续终生潜伏感染,对免疫力正常人群无显著影响,但是,如果由于疾病或其它原因导致宿主免疫力低下,该病毒即可活化从而造成难以治愈的复杂疾病。HCMV的活化可引发器官移植和艾滋病患者等高危人群产生间质性肺炎、肝炎、脑炎等严重复杂疾病,还可通过胎盘垂直传播导致死胎、新生儿感觉神经性听力丧失或精神发育迟缓等不良后果;另外HCMV还可促进器官移植后的免疫排斥反应、恶性肿瘤以及动脉粥样硬化等重要疾病的发病进程。由于HCMV在自然界广泛存在,传播途径多样,加之其感染正常群体一般无明显症状,预防该病毒感染较难实现,而体内已有潜伏感染的病毒DNA难以清除,因此防治HCMV相关疾病的重点主要放在探寻病毒活化的机制,以便找寻有效的抑制病毒活化的手段。HCMV的主要立即早期基因(MIE)的编码产物对调节活化后的基因表达起着不可或缺的作用,该基因的表达决定着病毒复制的效率。MIE基因表达的异常增高标志着HCMV转向活化状态,因此,上游调控MIE基因表达的众多分子成为研究HCMV活化的热点。US28是一种HCMV编码的在病毒活化的立即早期就表达的受体蛋白。研究表明,US28的变化先于MIE基因的转录,并能够引起经典的G蛋白相关信号转导。这是由于US28分子G蛋白偶联受体的结构使其具有影响下游细胞信号转导级联网络从而激活多种转录因子的功能。被激活的多种转录因子,特别是通用转录因子——环单磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)很有可能参与MIE基因的转录激活,从而参与病毒活化的过程。为了确定US28分子对MIE基因表达的影响以及作为HCMV活化的重要分子开关的作用,本研究重点开展了以下几方面工作:1.利用高保真酶从HCMV(AD169株)原液中扩增出US28全长表达序列,并将该基因克隆至真核表达载体上,以供胞内表达该蛋白时使用。将重组质粒的双向测序得出的序列与已报道的AD169序列进行同源性比对的结果表明,所克隆的US28基因与报道的序列完全相符。2.将上述重组质粒梯度转染至HEK293细胞中,24h后收获细胞中的总蛋白,采用Western blot技术检测其中CREB的生物活性形式——磷酸化CREB(p-CREB)量的变化情况,发现p-CREB与US28转染量呈明显的剂量依赖关系,这与单纯加入腺苷酸环化酶激活剂forskolin的结果呈现相同的趋势。而CREB分子的特异性阻遏物A-CREB在胞内的表达未能影响到p-CREB量的变化。3.建立了双萤光素酶报告基因检测系统,以观察上游多种影响因素对MIE基因转录活性的影响。该系统由萤火虫萤光素酶报告基因和海肾萤光素酶报告基因组成,本研究将MIE基因的增强/启动子克隆至萤火虫萤光素酶基因之前引导该报告基因转录;并选用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)的启动子区域引导的海肾萤光素酶基因作为内对照基因,这是由于该启动子不受本实验条件变化的影响。首先确定了两种报告基因的转染比例,以保证两基因的相对转录活性在一定范围内。之后将上述两种报告基因与US28真核表达载体共转染至HEK293中,观察US28对MIE基因转录活性的影响。同时,为了观察US28对CREB相关转录活性的影响,本研究利用CREB指示报告基因(人糖蛋白激素α亚基基因部分增强/启动子引导的萤火虫萤光素酶基因)与上述海肾萤光素酶基因构成双萤光素酶报告基因检测系统,并通过在该系统中共转染US28真核表达载体来观察US28对CREB相关转录活性的影响。利用通路阻断技术进一步研究了CREB分子在US28调节MIE等基因的信号通路中所起的作用。研究结果显示,在多种质粒共转染的双萤光素酶报告基因检测系统中可观察到US28和forskolin均能提高MIE与CREB指示报告基因增强/启动子的转录活性。US28对MIE等基因转录活性的促进作用可被A-CREB部分阻断,并且这种促进作用可由添加forskolin而再次提升。这说明CREB在US28提高MIE基因转录活性中具有重要的调节作用。4.建立了Real-time PCR法检测HCMV拷贝数的绝对定量的方法和检测MIE基因表达水平的相对定量的方法,利用上述两种方法观察了HCMV感染其宿主细胞——人胚肺成纤维细胞(HEL)后不同时间点病毒拷贝数与MIE基因表达水平的相关性。结果显示,MIE基因的表达产物在病毒感染细胞后短时间内即可产生,其表达水平随感染时间的延长而呈指数增长,病毒拷贝数也随之急剧增加。本研究结果显示:p-CREB的表达量与US28的转染量呈剂量依赖关系,说明US28分子通过其下游细胞信号转导通路上调CREB活性形式的表达量,提示US28很可能促进CREB相关基因的转录活性。通过对US28导致CREB指示报告基因转录活性增强的结果分析,进一步证实了US28可促进CREB相关基因的转录活性。更为重要的是,US28还可促进MIE基因的转录活性,并且这种促进作用可被A-CREB所部分阻断,说明CREB是该过程中的重要作用因子,而且是与其它转录因子共同参与这一促进作用。MIE表达水平的指数增加与病毒活化导致的拷贝数增加在表达时相上有着先后出现的密切关系。由于US28能通过CREB有效促进MIE基因的转录活性,而MIE基因的表达又与病毒拷贝数的增加密切相关,这一主线说明US28在HCMV活化通路中起着重要作用。本研究结果证明了US28通过CREB因子对于MIE基因转录活性增强的重要作用,这一结果为找到HCMV活化初始MIE表达急剧增加的诱因提供了有效的线索,这为今后深入开展HCMV潜伏与活化的研究工作奠定了一定的理论基础,也为寻找新的抗HCMV药物靶点提供了新的思路。