糖尿病胃轻瘫是糖尿病患者常见的一种慢性并发症,是指在无机械性梗阻情况下,继发于糖尿病的以胃动力低下、胃排空延迟、胃运动节律紊乱等为主要特征的临床症候群。糖尿病胃轻瘫病因复杂,是综合多种因素共同作用的结果,其中包括高血糖引起的氧化应激导致神经病变如肠神经和自主神经损伤、胃肠激素分泌异常、胃肠平滑肌病变、Cajal间质细胞（interstitial cell of Cajal,ICC）损伤等因素。本文主要关注了糖尿病引起的ICC和NOS神经元损伤及其机制的研究。ICC作为胃肠平滑肌自律性运动的起搏细胞,在胃肠道中扮演着重要的作用。ICC网络状结构被破坏,可以引起胃肠动力障碍,导致胃排空障碍甚至胃轻瘫。ICC的发育、表型的维持、增殖与分化依赖于干细胞生长因子（stem cell factor,SCF）。有研究报道,外源性的补充SCF可以部分逆转糖尿病胃轻瘫引起的ICC损伤,维持ICC表型的SCF只有在胃肠道平滑肌上有表达。众所周知,除全身性的肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensinsystem,RAS）外,在心血管等器官组织中还存在相对独立的局部RAS,它们通过旁分泌和（或）自分泌方式直接调节心血管活动。已经有研究报道,胃肠道黏膜上存在血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）,说明AngⅡ可以在粘膜局部生成。研究表明,Ang除了参与水盐平衡调节,还可以促进一些生长因子生成,例如胰岛素样生长因子（IGF-1）、血小板源性生长因子（PDGF）等。因此,我们可以假设,胃局部AngⅡ可能参与胃肠平滑肌增殖与分化,增加平滑肌膜结合型干细胞生长因子（membrane binding stem cell factor,mSCF）的表达,维持ICC的表型和功能。大量研究表明,除ICC损伤之外,肠神经元的损伤是引起糖尿病胃轻瘫的常见因素。而有趣的是,在糖尿病小鼠的消化道,抑制性神经元,比如NO能神经元,较其它类型的神经元更容易损伤,即在糖尿病发病2周左右开始出现NOS神经元损伤。然而,糖尿病引起NOS神经元损伤的机理还不十分清楚。因此,在糖尿病发生发展过程中,预防和治疗NOS神经元损伤是防治胃轻瘫发生的重要环节。研究表明,在中枢和周围神经系统有大量的嘌呤能受体P2X₇分布,而P2X₇与神经元损伤有密切关系。激活P2X₇引起大鼠视网膜神经节死亡,在体外实验中P2X₇激动剂BzATP可引起视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）内钙离子浓度升高引起RGCs死亡。文献也报道,在溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis）和克罗恩病（Crohn’s disease）,因长期激活P2X₇受体从而选择性损伤NOS神经元,引起结肠运动障碍。本文结合了分子生物学和电生理学方法,在链脲佐菌素（Streptozotocin,Streptozocin,STZ）诱导的糖尿病小鼠模型上,分两部分研究了糖尿病引起胃ICC和NOS神经元损伤及其机理。首先,用免疫组织化学的方法观察了糖尿病小鼠胃平滑肌层ICC数量改变情况,同时观察了NOS神经元的数量改变。接着,从功能实验进一步证明,在糖尿病发展过程中胃ICC和NOS神经元受损伤。其次,用免疫印迹和相对定量PCR方法,检测了AngⅡ及其受体在糖尿病小鼠胃平滑肌组织中表达变化以及P2X₇受体和pannexin-1的表达变化。最后,在体外培养的平滑肌细胞上探讨了AngⅡ对胃平滑肌细胞SCF的表达变化及其具体信号通路机制。利用膜片钳技术和钙成像技术继续探讨了激动P2X₇受体引起NOS神经元损伤的机制。研究结果如下:一、胃局部RAS参与糖尿病ICC损伤的代偿过程及其机制1.用STZ（链脲佐菌素）诱导I型糖尿病小鼠模型2个月后结果显示,与正常小鼠相比,糖尿病小鼠的血糖为正常小鼠的3倍,而体重明显低于正常小鼠。2.免疫组织化学结果显示,在糖尿病小鼠中ICC网络状结构遭到严重的破坏,包括ICC-IM和ICC-MY数量明显减少。免疫蛋白印迹结果显示,在糖尿病小鼠中mSCF和c-Kit蛋白表达量显著性减少。3.荧光定量PCR结果显示,与正常小鼠比较,糖尿病小鼠胃平滑肌组织血管紧张素Ⅱ受体1（angiotensin Ⅱ receptor 1,AT1R）亚型AT1aR和AT1bR的mRNA水平明显上调。同时,免疫蛋白印迹实验结果表明,糖尿病小鼠胃粘膜上ACE的表达水平和胃平滑肌上AT1受体表达明显增加。4.离体的肌条收缩实验结果表明,糖尿病小鼠胃窦平滑肌收缩能力弱于正常小鼠的收缩能力;AngⅡ可以显著增强胃窦平滑肌收缩的幅度和张力,糖尿病小鼠胃平滑肌对AngⅡ的反应更加敏感。5.用酶联免疫吸附法测定正常和糖尿病小鼠血浆AngⅡ浓度。结果显示,糖尿病小鼠血浆中AngⅡ的浓度明显高于正常小鼠。6.利用cell counting kit-8试剂盒检测AngⅡ对胃平滑肌增殖的影响。结果显示,AngⅡ浓度依赖性地促进胃平滑肌细胞的增殖;AT1阻断剂ZD7155明显阻断AngⅡ对胃平滑肌的增殖作用,而AT2阻断剂PD123319没有此作用。结果表明,AngⅡ促进胃平滑肌的增殖是通过AT1受体而不是AT2受体。7.通过免疫蛋白印迹方法检测AngⅡ对胃平滑肌mSCF表达的影响。结果显示,AngⅡ浓度依赖地增加平滑肌mSCF的表达,AT1阻断剂ZD7155能明显阻断AngⅡ的作用,而AT2阻断剂PD123319没有作用。8.为了探讨AngⅡ上述作用的机理,利用免疫蛋白印迹方法观察了AngⅡ对PI3k/Akt信号通路的影响。实验结果表明,AngⅡ显著促进Akt-Ser473的磷酸化,AT1阻断剂ZD7155和PI3k的阻断剂LY294002能阻断AngⅡ对Akt-Ser473的磷酸化作用,并且也能够阻断AngⅡ促进平滑肌细胞增殖和胃平滑肌mSCF表达的作用。以上结果提示:（1）在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中,胃ICC网络状结构明显受损,胃平滑肌mSCF的表达下调,同时胃局部的RAS处于明显激活状态;（2）AngⅡ通过PI3k/Akt信号通路促进胃平滑肌的增殖和胃平滑肌mSCF的表达;（3）ACE-AngⅡ-AT1的上调对糖尿病引起的ICC损伤起代偿作用。二、P2X₇受体参与糖尿病引起的胃NOS神经元损伤过程1.免疫组织化学和免疫蛋白印迹结果显示,在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中NOS神经元数量和nNOS蛋白表达明显减少;平滑肌功能实验结果显示,电场刺激诱导的舒张反应中由NO引起的舒张作用明显受到抑制。2.免疫组织化学和免疫细胞化学结果显示,肠神经元上有P2X₇受体和pannexin-1的表达,并且免疫蛋白印迹和相对定量PCR结果表明,糖尿病小鼠胃平滑肌P2X₇受体和pannexin-1的表达明显上调。3.利用质粒转染技术将P2X₇受体转入Hek293细胞,进行钙成像实验。结果表明,P2X₇激动剂BzATP引起转染P2X₇的Hek293细胞Ca²⁺内流明显增加,而且与没有转染P2X₇的Hek293细胞相比,在转染P2X₇的Hek293细胞ATP诱导的Ca²⁺离子内流明显增加。4.单细胞膜片钳结果显示,在转染P2X₇受体的Hek293细胞,BzATP可以浓度依赖地激活内向的电流,并且无脱敏现象。5.YO-PRO-1大分子荧光穿透实验结果显示,Hek293-P2X₇细胞可以让YO-PRO-1透过,而未转染的Hek293细胞则不能透过。在用P2X₇阻断剂oxATP和pannexin-1阻断剂CBX预处理后,能部分阻断Hek293-P2X₇细胞对YO-PRO-1的吸收。以上结果提示:（1）在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中,NOS神经元明显受损,并且肠神经元上的P2X₇受体和pannexin-1表达明显上调;（2）在糖尿病中,P2X₇和pannexin-1被激活,并且P2X₇和pannexin-1形成孔膜,使分子量较大的有机阳离子和Ca²⁺内流到细胞导致NOS神经元损伤。三、小结以上两部分的实验可以归纳为以下三点:1.糖尿病导致胃ICC和NOS神经元损伤,这可能是引起糖尿病胃动力异常的重要原因之一。2.胃肠道局部RAS的AngⅡ通过PI3k/Akt信号通路参与胃平滑肌的增殖和平滑肌细胞mSCF的表达,可能与维持ICC表型有关;在糖尿病引起局部RAS活性上调可能部分代偿糖尿病ICC的损伤。3.P2X₇和pannexin-1在肠神经系统有表达,在STZ诱导的糖尿病小鼠,P2X₇和pannexin-1表达明显上调;糖尿病引起的P2X₇和pannexin-1上调形成孔膜,使大分子物质和Ca²⁺内流导致NOS神经元损伤。