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本研究采用细胞培养、CCK-8、细胞划痕、Transwell、RT-PCR、细胞周期、JC-1、DAPI染色、AV/PI、Western blot分析、裸鼠皮下移植瘤等细胞和分子生物学技术,主要以HepG2和SMMC-7721两种人源肝癌细胞系为实验对象,研究了EGCG对其增殖、迁移、细胞周期、线粒体膜电位与凋亡的影响。结果如下:1 EGCG抑制细胞增殖与迁移为了确定EGCG对HCC细胞的影响,用0、1、5、10、20、50、100、150、200μM EGCG分别处理包括HepG2、SMMC-7221和LO2在内的三种肝细胞系24 h和48 h之后使用CCK-8评估细胞增殖抑制率。随着药物浓度的增加,两种癌细胞增殖能力显著降低,而正常肝细胞的活力并未有明显影响。之后我们还通过使用细胞划痕(0、50、100μM)和Transwell测定来测量EGCG(0、50、100、150、200μM)对HepG2和SMMC-7721细胞迁移的影响。Transwell结果显示与对照组相比,EGCG处理组中两种细胞系的迁移强度显著减弱。RT-PCR结果显示,两种细胞系中MMP-2和MMP-9的RNA表达水平显著降低(P<0.05)。结果显示:EGCG降低HepG2和SMMC-7721细胞的细胞活力,抑制增殖,而EGCG对LO2细胞的细胞活力的影响较小;EGCG抑制HepG2和SMMC-7721细胞的迁移。提示:EGCG可以抑制细胞增殖与迁移。2 EGCG诱导细胞周期阻滞为了阐明EGCG诱导的细胞生长抑制是否通过细胞周期进展的改变介导,用0、50、100、150、200μM EGCG分别处理包括HepG2细胞和SMMC-7221细胞24 h。之后我们通过细胞周期染色缓冲液(Cell cycle staining Buffer)染色后在一小时内使用流式细胞仪测定细胞周期分布。并使用Western blot分析相关蛋白的表达情况。结果显示:EGCG在HepG2和SMMC-7721细胞中引起S期的显著停滞;Western blot结果显示,与对照组相比,实验组的两种细胞系中Cyclin D1、Cyclin E、p27、p21蛋白表达水平均升高,而Cyclin A蛋白表达水平降低。提示:EGCG诱导细胞周期阻滞于S期。3 EGCG导致细胞线粒体膜电位降低并诱导细胞凋亡为了验证EGCG是否可以与肝癌细胞的凋亡有关,用不同浓度EGCG分别处理两种细胞24 h。之后分别使用JC-1、DAPI、AV/PI双染法测定了加药处理后细胞状态的改变,并使用Western blot分析相关蛋白的表达情况。结果显示:当HepG2和SMMC-7721细胞暴露于EGCG时,线粒体膜电位(ΔΨm)显著降低;使用DAPI染色检测出具有核碎裂和缩合的细胞(细胞凋亡的标志);双染法流式细胞术结果显示随着加药浓度增高肝癌细胞的凋亡率(早凋、晚凋、坏死)增加;处理后Bax蛋白的表达显著增加,Bcl-2蛋白的表达则被下调;凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的剪切活化形式的表达也被上调。提示:EGCG在两种肝癌细胞中可降低ΔΨm并诱导凋亡相关蛋白质的差异表达,最终导致细胞凋亡。4 EGCG抑制裸鼠皮下移植瘤的生长选取20只4~6周的雌性裸鼠,体重为14~16 g。将培养的人源肝癌细胞HepG2的数量调整至1×10~7个/mL,用无血清的培养基重悬细胞注射入裸鼠后腿侧。当小鼠皮下肿瘤的大小大概增殖至80-100mm~3时,给携带肿瘤的小鼠皮下注射EGCG(10、20、40 mg/kg)和生理盐水作为对照,隔天给药共5次。每天观察肿瘤生长状况并称量体重。实验完成后处死小鼠剥离瘤块,测量并称重。结果显示:给药组与对照组相比,肿瘤增殖速度减慢,瘤重差异明显。提示:EGCG可抑制裸鼠移植瘤的生长。