背景:肺癌是世界严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,其死亡率位居恶性肿瘤死亡首位。肺癌因其恶性程度高,患者生存率较低,五年总生存率约为16.1%,大多数肺癌患者就诊时已属晚期,失去手术治疗的机会,目前针对肺癌的治疗方法主要采用放疗、化疗及靶向治疗等手段。放射治疗是肺癌患者的重要局部治疗手段,在肺癌的治疗中起着重要的作用,大约60%-70%的肺癌患者在治疗期间都需要接受不同程度的放射治疗。但是由于治疗期间产生放疗抵抗的因素,如一味增加放射治疗剂量,虽然提高了肿瘤控制率,但同时也增加了对周围正常组织器官的毒副作用,造成周围组织损伤。因此如何提高放疗疗效,同时减少正常组织损伤,一直是放疗科医师的研究热点。Warburg效应,也称“有氧糖酵解”,是肿瘤细胞一种独特的代谢供能方式,指肿瘤细胞即使在氧充足的条件下,比正常细胞需要更多的葡萄糖经能量代谢途径转化为乳酸。有氧糖酵解有利于恶性肿瘤细胞发展,减缓细胞凋亡、增加侵袭性、产生免疫逃逸、产生药物耐药等。肿瘤细胞的这种灵活性代谢方式,使肿瘤细胞在发生发展中有充分的“物质基础”对抗外界环境带来的变化和刺激。糖酵解过程的三个限速酶调节糖酵解的三步重要的不可逆反应,影响细胞整体糖酵解水平,其中丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途径中最后一个关键限速酶,催化ATP将高能磷酸键转移给丙酮酸形成磷酸烯醇式丙酮酸和ADP。但PK的不同同工型具有组织特异性,PKM2亚型成为肿瘤细胞特征性的糖代谢酶,因此也被称之为肿瘤M2型丙酮酸激酶(TumorM2pyruvatekinase,TUM2-PK)。而PKM2在肿瘤代谢中,有非常重要的作用,其上调可以增加肿瘤细胞对葡萄糖的利用和改变氧化还原反应的平衡,这样一个代谢转变促进肿瘤细胞合成多种中间体和代谢产物,供肿瘤细胞无限增殖并提供物质基础。有研究表明在非小细胞肺癌细胞中,靶向PKM2应用小分子抑制剂,可以促进其细胞凋亡;在肺腺癌裸鼠移植瘤模型中,抑制PKM2的酶活性使肿瘤瘤体缩小,这些证据都表明PKM2在肿瘤有氧糖酵解和肿瘤治疗过程中的重要作用。研究表明,糖酵解水平和放疗敏感性密切相关,正是肿瘤细胞存在的Warburg现象,使得肿瘤细胞相比正常细胞对辐射具有天然的抗性,可以靶向Warburg效应,根据肿瘤糖酵解与辐射抗性相关研究结果制定相应的治疗措施,成为癌症放疗的发展方向之一。已有学者证明,抑制糖酵解过程可以增加肺癌、乳腺癌、宫颈癌等多种癌症的放疗及化疗敏感性。前期我们应用生物信息学,利用TCGA数据库中的高通量基因组数据,使用GSEA富集分析出“糖酵解”这一生物过程在肺癌的发生发展具有重要作用,同时还富集出在“糖酵解”这一生物过程中可能参与的基因,通过R语言计算机运算和风险回归模型构建一组由四基因(AGRN、HMMR、AKR1A1、DDIT4)组成的可以预测患者预后的分子标志物。其中,HMMR(透明质酸受体)作为四基因的核心基因,进行深入研究。透明质酸介导的运动受体(RHAMM,也称为HMMR或CD168)是人们发现的第一个与细胞相关的透明质酸介导的受体,它在细胞表面以及细胞质和细胞核中以多种形式存在。研究证实胞内HMMR同时结合肌动蛋白和微管细胞骨架,除了与ERK和SRC激酶相互作用外,细胞内HMMR还与许多蛋白质结合,调节微管动力学和中心体结构和功能,从而促进微管介导的细胞极性和细胞迁移。但HMMR与糖酵解之间的关系尚不明确。根据生物信息学结果,发现HMMR可能参与肺腺癌的糖酵解过程并可作为分子标志物预测肺腺癌患者的预后,本研究旨在前期基础上探索HMMR与糖酵解之间的相关性及其对肺腺癌放疗敏感性的影响,通过蛋白组学等实验方法,探讨HMMR与PKM2的可能关系,通过体内动物模型,验证Si-HMMR对肺腺癌是否具有增敏作用。本研究丰富了现有的对HMMR基因的研究,为其可能成为肺腺癌预后及放疗敏感性的分子标志物提供理论依据,使临床医生对肿瘤的个体化治疗和精准医疗成为可能。方法:1、从TheCancerGenomeAtlas(TCGA)中获取1038例肺癌患者和108例癌旁患者的信息。采用基因集富集分析(GSEA)、R语言方法对提取数据进行单因素和多因素Cox回归分析。根据分析所得结果建立风险模型,计算511例肺腺癌患者的评分,将511例肺腺癌患者分为高风险组和低风险组,多因素Cox回归和分层分析判断基因分子标志物是否为独立预后因素。2、采用CCK8法确定不同浓度的糖酵解抑制剂2-DG对肺腺癌细胞系H1299,A549和H1975细胞增殖和活力的影响,并确定不同细胞系IC50浓度。3、应用0、1/2IC50、IC50三个浓度梯度处理不同肺腺癌细胞,采用qPCR方法检测肺腺癌细胞系四个基因AGRN、AKR1A1、DDIT4、HMMR表达量的变化,选取变化趋势最稳定和最显著的基因—HMMR作为本文主要研究基因。4、应用qPCR、WesternBlot、免疫组化三种实验方法检测三株肺腺癌细胞系、8对肺腺癌组织标本和42对肺癌组织病理石蜡切片的HMMR表达量,验证TCGA生物信息数据分析结果。5、采用RNAi技术、构建HMMR沉默和过表达载体、qPCR、WesternBlot和免疫荧光技术,检测沉默和过表达HMMR后不同肺腺癌细胞乳酸、葡萄糖含量及相关蛋白表达变化情况;同时应用海马能量代谢仪检测HMMR表达变化对肺腺癌细胞糖酵解的影响。6、采用不同放射剂量(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy)照射H1299和A549肺腺癌细胞系,采用平板克隆形成实验分析Si-HMMR对放疗敏感性的影响。7、采用裸鼠荷瘤实验,在体验证Si-HMMR对肺腺癌放疗敏感性的影响。8、采用H1299过表达HMMR后,进行蛋白质谱分析和鉴定,确定可能与HMMR相互作用的蛋白质。根据蛋白质谱分析结果,选取和糖酵解相关的相互作用蛋白PKM2进行研究,并应用qPCR、WesternBlot、酶活性检测、免疫荧光共定位、CO-IP检测HMMR和PKM2之间蛋白相互作用以及HMMR表达变化对PKM2mRNA水平、蛋白水平和酶活性的影响;应用免疫组化方法分析肺腺癌病理组织切片,检测HMMR与PKM2协同表达情况。结果:1、和糖酵解相关的四基因(AGRN、HMMR、AKR1A1、DDIT4)组成的一组肺腺癌分子标志物是预测肺腺癌患者预后的独立指标,与其他临床特征相比,具有稳定性和早期指导意义。2、HMMR在A549、H1299和H1975中mRNA水平和蛋白水平均较对照组HBE细胞系表达增高;8对肺腺癌组织标本和42例肺腺癌病理石蜡切片中,HMMR蛋白表达水平较癌旁组织相比,显著增高。3、免疫荧光显示HMMR主要定位在肺腺癌的细胞胞质中。4、Si-HMMR细胞系组相比对照组,乳酸含量减少、葡萄糖消耗量无显著差异。过表达HMMR细胞系和对照组,乳酸含量增多、葡萄糖消耗量增多。5、海马能量代谢仪显示,Si-HMMR细胞系组相比对照组,ECAR减少,说明糖酵解能力降低;过表达HMMR细胞系组相比于对照组,ECAR增高,糖酵解能力增加。6、体内、体外模型表明Si-HMMR可以增强肺腺癌的放疗敏感性。7、蛋白组学分析,HMMR与PKM2存在相互作用关系。8、Si-HMMR降低PKM2蛋白表达量和酶活性;过表达HMMR增加PKM2蛋白表达量和酶活性。9、免疫荧光共定位显示HMMR与PKM2存在相互作用。10、免疫共沉淀证实HMMR与PKM2存在相互作用。11、大数据及免疫组化分析表明HMMR与PKM2存在正相关性,协同表达结论:1、HMMR可以作为肺腺癌患者独立的预后指标;2、HMMR表达变化影响肺腺癌细胞糖酵解;3、HMMR通过直接与PKM2蛋白相互作用影响其酶活性,参与糖酵解过程;4、HMMR表达变化可以影响肺腺癌细胞的放疗敏感性,可能成为肺癌放射治疗的潜在增敏靶点。