第一章人早发性卵巢功能不全存在TH1/Treg细胞免疫失衡背景:早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性在40岁之前发生卵巢功能衰竭,以闭经、促性腺激素水平升高、雌激素降低为主要特征。POI的临床表现多样,发病机制复杂,目前半数以上患者病因未明。其中5%-30%患者可由自身免疫性因素引起,称为自身免疫性POI。但是目前尚无可靠的自身免疫性POI的预测和诊断指标,自身免疫失调导致卵巢损伤和功能障碍的机制亦不明确。既往研究发现卵巢炎患者的病理组织学检查示卵巢内有大量的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞浸润,以CD3+T细胞,特别是CD4+T细胞为主。在POI患者的外周血中也发现有数量异常的T淋巴细胞和炎性细胞因子。活化的T细胞可能通过释放一系列促炎性细胞因子而持续诱导特异性的免疫应答,干扰卵泡生长发育,破坏卵巢功能。调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)是一类具有免疫负调节作用的细胞,在维持自身免疫平衡中发挥关键作用。Treg免疫维稳作用受到破坏是自身免疫性疾病发生的重要原因。既往POI免疫细胞的研究相对较少而且样本量较小,尚未得出一致的结论。目前对于POI尚无全面的免疫细胞亚群及细胞因子谱研究,POI是否存在及存在何种T淋巴细胞或者细胞因子免疫失调尚不清楚。目的:探讨POI患者外周及卵巢局部细胞因子谱及淋巴细胞亚群异常,探究免疫异常指标与POI疾病进展的相关性,初步明确POI患者的细胞免疫异常。方法:应用ELISA方法检测POI患者与健康对照者外周血清中差异表达的细胞因子,通过流式细胞术检测炎性细胞因子的主要细胞来源以及外周血中Treg细胞的数量及功能变化。利用ELISA及实时荧光PCR技术检测生化异常期POI(biochemical premature ovarian insufficiency,bPOI)及卵巢储备正常女性的卵泡液及颗粒细胞中细胞因子的表达。采用相关性分析验证免疫指标与卵巢功能相关指标的相关性结果:(1)POI患者外周及卵巢局部存在TH1炎性反应升高通过对POI患者及健康对照者的血清检测发现,在POI患者外周血清中,IFN-γ(P<0.0001)和TNF-α水平显著升高(P=0.0006),TGF-β水平显著降低(P<0.0001),IL-4(TH2)、IL-17(TH17)和IL-10 在两组人群间的表达无显著差异。通过流式检测分析发现CD3+TNF-α+(P=0.0196)、CD3+IFN-γ+(P=0.0462)和CD3+TNF-α+IFN-γ+T(P=0.0164)细胞比例在POI患者中明显升高。CD3+IL-17+以及CD3+IL-10+T细胞亚群在两组间无显著差异(P>0.05)。CD4+和CD8+T淋巴细胞比例在两组间的表达也无显著性差异(P>0.05)。在卵巢局部,bPOI患者的卵泡液中TNF-α(P=0.0487)显著升高,IL-10水平显著降低(P=0.0002)。IFN-γ的阳性检测率在bPOI患者卵泡液中也显著高于健康对照者(P<0.0001)。利用实时定量PCR在bPOI患者的颗粒细胞中检测到显著上调的IFNG、TNF和下调的TGFB(P<0.05),两组间IL17、IL4及IL10的表达无显著差异(P>0.05)。(2)POI患者外周Treg细胞数量下降,免疫抑制功能受损利用流式免疫标记检测POI患者及健康女性外周血PBMC中CD4+CD25hi Foxp3+Treg的数量及表型发现,与健康对照者相比,CD4+CD25hi Foxp3+Treg细胞比例和绝对数量在POI患者中显著下降(P=0.0089;P=0.0371)。为明确Treg细胞数量减少的原因,通过检测Treg细胞内Ki-67的表达,发现在POI患者Treg细胞中Ki-67表达明显下调(P=0.028)。同时,POI患者的Treg细胞凋亡比例显著上升(P=0.0345)。分析Treg细胞发挥免疫抑制功能指标Foxp3,CTLA-4和GITR的表达后发现,POI患者Treg细胞中Foxp3的平均免疫荧光强度(MFI)(P=0.0318)及CTLA-4阳性率表达显著下调(P<0.0001),GITR的表达在两组间无显著差异(P=0.6660)。(3)TH1/Treg细胞失衡与POI疾病的严重程度相关为进一步明确TH1:Treg是否与POI疾病的严重程度相关,我们将炎性指标与卵巢功能相关指标进行相关性分析发现,外周IFN-γ和TNF-α水平与FSH水平正相关(IFN-γ:FSH,R=0.36,P<0.001;TNF-α:FSH,R=0.43,P=0.002),而与E2水平负相关(IFN-γ:E2,R=-0.29,P<0.001;TNF-α:E2,R=-0.47,P=0.001);外周TGF-β与FSH水平负相关,而与E2水平正相关(TGF-β:FSH,R=-0.37,P<0.001;TGF-β:E2,R=0.29,P<0.001)。Treg细胞亚群比例与FSH水平呈负相关性,而与 E2、T 水平呈正相关性(Treg:FSH,R=-0.25,P=0.047;Treg:E2,R=0.27,P=0.04;Treg:T,R=0.27,P=0.04)。Treg:CD3+TNF-α+和Treg:CD3+TNF-α+IFN-γ+细胞比例与FSH、E2、T水平也具有相似的相关性(Treg:CD3+TNF-α+:FSH,R=-0.29,P=0.02;Treg:CD3+TNF-α+:E2,R=0.29,P=0.03;Treg:CD3+TNF-α+:T,R=0.31,P=0.02。Treg:CD3+TNF-α+IFN-γ+:FSH,R=-0.33,P=0.01;Treg:CD3+TNF-α+IFN-γ+:E2,R=0.31,P=0.02)。Foxp3 MFI 以及 CTLA-4 的表达量与 FSH 水平具有负相关性(Foxp3:FSH,R=-0.26,P=0.04;CTLA-4:FSH,R=-0.38,P=0.01)。结论:POI患者的外周及卵巢局部存在着异常升高的TH1炎性反应,Treg细胞数量减少及免疫抑制功能受损可能是导致这一现象的原因。TH1:Treg细胞与POI疾病严重程度的相关性,进一步提示TH1:Treg细胞免疫失衡可能会影响卵巢功能,从而导致POI疾病的发生。第二章TH1/Treg细胞免疫失衡导致小鼠卵巢功能不全背景:第一章研究发现在POI患者的外周和卵巢局部存在过度活化的TH1炎性反应,同时发现Treg细胞数量减少和免疫功能受损,上述免疫异常与POI疾病进展具有相关性,提示Treg细胞可能对维持卵巢功能具有重要作用,TH1/Treg失衡可能是导致人POI发生的重要自身免疫异常。但是TH1/Treg失衡是否真正具有致病作用及其可能的机制尚不清楚。受限于人卵巢样本的不可获得性,需要借助合适的小鼠模型验证TH1/Treg失衡导致的TH1免疫反应损害卵巢功能的作用及其机制。既往借助自身免疫性卵巢疾病动物模型,如Aire基因敲除小鼠、新生第三天小鼠胸腺切除、卵巢相关抗原或多肽ZP3及MATER主动免疫诱导小鼠自身免疫性卵巢炎等,发现小鼠卵巢病理学表型与人POI患者的卵巢表型相似。这些动物模型大多只关注卵巢存在炎性细胞浸润,并未对卵巢损伤机制进行深入探讨,而对Treg细胞在POI发病中的作用研究亦甚少。因此,本研究通过构建新的自身免疫性小鼠模型模拟TH1/Treg细胞失衡导致POI的发病过程,为研究自身免疫性POI的发病机制及干预手段提供详实的科学证据。目的:利用Rag2-/-敲除小鼠过继转输Naive T细胞构建自身免疫性POI小鼠模型,对激素水平、卵巢大小、形态、各级卵泡数量、颗粒细胞功能等进行评估,检测模型小鼠卵巢及外周淋巴器官TH1、Treg等淋巴细胞亚群变化及多种细胞因子表达,明确异常TH1炎性反应损害卵巢功能的机制;并同时过继转输Treg细胞,观察其对卵巢损伤和POI疾病的预防和挽救作用。方法:应用流式分选技术从Foxp3YFP-Cre小鼠的脾脏及外周淋巴结中分选出CD4+CD25-45RBhi 细胞(Naive T 细胞)及 CD4+CD25+Foxp3-YFP+细胞(Treg 细胞)。Rag2-/-受体小鼠分为三组,分别腹腔注射PBS(对照组)、CD4+CD25-45RBhi细胞(POI 组)以及 CD4+CD25-45RBhiCD4+CD25+Foxp3-YFP+细胞(POI+Treg 组)。利用HE及免疫组织化学技术观察小鼠的卵巢组织学改变,电化学发光法检测外周血雌二醇及孕激素水平变化。利用流式免疫标记技术检测小鼠卵巢及外周淋巴器官的炎性细胞表达,同时利用实时定量PCR检测卵巢内细胞因子、趋化因子及激素合成相关基因的表达。结果:与对照组相比,注射CD4+CD25-45RBhi细胞的Rag2-/-受体小鼠(POI组)表现出卵巢功能不全表型,即卵巢体积明显变小、总卵泡数及各级卵泡数明显减少。小鼠雌、孕激素水平下降。每个生长卵泡周围的颗粒细胞cleaved PARP阳性率显著增多。POI组小鼠卵巢内促炎性细胞因子(Ifng、Tnf、Il1b)和趋化因子(Ccr1、Ccr2、Cxcl10、Cxcl17)表达明显升高,而激素合成相关基因(Cyp17a1、Cyp19a1、Cyp11a1、Star、Lhr)表达明显降低。流式分析发现卵巢内有大量的CD4+IFN-γ+TNF-α+T细胞浸润,而Foxp3+Treg细胞缺失,提示TH1炎性反应可导致卵巢功能不全。相反地,与对照组小鼠相比,过继转输Treg细胞的小鼠卵巢大小及各级卵泡数无明显差异,卵巢内仅有少量淋巴细胞浸润。与POI组相比,POI+Treg组小鼠的血清雌、孕激素水平显著增加,卵巢、脾脏以及卵巢引流淋巴结内的CD4+IFN-γ+和CD4+TNF-α+T细胞的比例显著降低。卵巢激素合成相关基因(Cyp17a1、Cy19a1、Cyp11a1)的表达有升高趋势,同时伴有卵巢内促炎性细胞因子及趋化因子表达显著下调。回输Treg细胞可以有效地改善卵巢功能,预防和挽救卵巢功能不全。结论:TH1炎性细胞在小鼠卵巢内大量浸润,可引起卵巢颗粒细胞凋亡增加,抑制激素合成,损伤卵巢功能,导致小鼠卵巢功能衰竭。Treg细胞可减少TH1细胞引起的卵巢功能损伤,预防卵巢功能不全发生。第三章TH1炎性细胞因子对颗粒细胞功能的调控及相关信号通路机制研究背景:在生理状态下,外周循环中的细胞因子,以及卵巢内免疫及非免疫细胞分泌的细胞因子共同存在于卵巢免疫微环境内,对于卵泡的生长发育、排卵以及黄体生成、溶解具有重要意义。颗粒细胞的增殖分化对维持卵泡正常的生长发育具有重要作用,颗粒细胞功能异常是导致卵泡闭锁加速的主要原因之一。既往有研究发现细胞因子影响颗粒细胞生长以及激素合成,但异常表达的细胞因子是如何通过影响颗粒细胞功能,进而参与POI发病的相关机制研究较少。我们前两章研究发现人POI患者存在TH1免疫反应激活,小鼠模型证实TH1炎性反应可导致卵巢颗粒细胞凋亡增加、卵巢功能不全发生。但是对于1型炎性反应细胞因子对颗粒细胞的损伤作用及其机制仍不明确。目的:探讨TH1型炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α对颗粒细胞功能的影响,并进一步研究其发挥作用的信号通路和下游靶基因,以明确其导致颗粒细胞异常和卵巢功能不全的作用机制。方法:利用人重组IFN-γ(50.0ng/ml)或FNF-α(50.0ng/ml)蛋白单独或联合处理KGN细胞系48小时,采用凋亡、Edu实验、雌二醇合成实验以及实时荧光PCR和Western Blot检测颗粒细胞的生长和雌激素合成能力。利用实时荧光PCR和Western Blot检测颗粒细胞功能相关指标的表达变化,筛选出转录和翻译表达一致的标记物CTGF作为下游基因进行研究。进一步通过沉默颗粒细胞内源性CTGF表达,结合添加重组CTGF蛋白,检测颗粒细胞生长状态和雌二醇合成能力,明确CTGF对颗粒细胞的作用。通过添加JAK-STAT1及NF-κB信号通路抑制剂,探究JAK-STAT1及NF-κB信号通路在细胞因子调控颗粒细胞功能中发挥的作用。借助小鼠原代颗粒细胞进一步验证细胞因子对颗粒细胞功能的影响。结果:(1)TH1促炎性细胞因子抑制颗粒细胞生长及雌激素合成细胞因子IFN-γ或TNF-α可明显促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞增殖。细胞中显著升高的cleaved PARP和降低的PCNA蛋白进一步证实IFN-γ及TNF-α可以通过促进颗粒细胞凋亡和抑制增殖而损害细胞生长。此外,经细胞因子处理后,雌二醇合成能力下降,颗粒细胞CYP19A1表达显著下调。与单独使用一种细胞因子相比,IFN-γ及TNF-α联合作用对颗粒细胞的生长和激素合成的损伤作用要更为强烈。(2)TH1细胞因子通过JAK-STAT1及NF-κB信号通路调控CTGF的表达从而诱导颗粒细胞凋亡通过实时定量PCR检测与颗粒细胞功能相关的基因CTGF、WT1、INHBA、FOXO1及GATA6在细胞因子处理后的表达变化,发现IFN-γ和TNF-α单独或协同处理后,CTGF的表达下调在转录和翻译水平变化是一致的。为了明确IFN-γ和TNF-α对颗粒细胞功能的影响是否是由CTGF介导,敲降颗粒细胞内源性CTGF的表达后发现,CYP19A1的表达和雌二醇的合成未受影响,但可以显著促进颗粒细胞的凋亡、抑制细胞增殖。显著增加的Cleaved PARP蛋白和降低的PCNA蛋白进一步说明下调的CTGF抑制颗粒细胞生长。相反,在KGN细胞中加入外源性重组CTGF蛋白可以有效地减少细胞因子引起的颗粒细胞的凋亡。这些结果证实TH1细胞因子影响颗粒细胞的生长主要是通过下调CTGF的表达介导的。同时我们发现细胞因子处理后,STAT1、IKBα和P65磷酸化增加,JAK-STAT1及NF-κB信号通路被激活。添加JAK和IKBκ磷酸化的抑制剂后,可显著降低细胞因子对CTGF表达的抑制作用,但不影响细胞因子对CYP19A1的表达和雌二醇合成的抑制作用。综上所述,IFN-γ和TNF-α通过JAK-STAT1及NF-κB信号通路调控CTGF的表达从而影响颗粒细胞的生长。最后,用IFN-γ和TNF-α处理小鼠原代颗粒细胞后,颗粒细胞凋亡增加、激素合成减少。同时CTGF表达下降,JAK-STAT1及NF-κB信号通路被激活。进一步证实IFN-γ和TNF-α对颗粒细胞的促凋亡及抑制激素合成作用。结论:IFN-γ及TNF-α通过下调颗粒细胞CYP19A1的表达抑制雌激素的合成,并通过JAK-STAT1及NF-κB信号通路抑制CTGF的表达,从而促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞增殖,最终导致卵泡闭锁,卵巢功能异常及POI的发生。