缺血性脑血管病的发病率较高，是中老年人致死和致残的主要原因。因此，对缺血性脑血管病发病机制及其防治措施的研究仍是当前神经科学研究领域的一个热门课题。脑卒中的治疗方法是早期恢复血流再灌注，但当脑缺血超过一定时间后，恢复血流再灌注可造成缺血神经细胞损伤的进一步加重，即缺血再灌注损伤。近年来，在探讨脑缺血保护措施的同时，人们已开始注重调动脑的内源性保护机制以增强神经元对缺血性损伤抵抗能力的研究。1990年，Kitagawa等首先在沙土鼠脑缺血模型上观察到缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)的保护现象，即一次或多次短暂非致死性脑缺血再灌注能够诱导该缺血组织对以后较长时间的致死性缺血损伤产生显著的耐受性。然而，迄今为止有关缺血预处理的神经保护作用机制远未阐明。研究表明，缺血预处理能够通过调节凋亡相关基因Bc1-2和Bax的表达，减轻大鼠海马CA1区神经元缺血再灌注损伤，但IPC的神经保护作用是否与抑制线粒体途径凋亡有关，目前尚未见系统研究报道。本实验首次对缺血再灌注后线粒体途径凋亡上、下游基因的表达情况及IPC对其表达的影响进行了系统研究。线粒体解耦联蛋白-2(uncoupling protein 2，UCP2)广泛存在于组织细胞，是惟一一种在脑组织中(包括海马)表达的线粒体膜蛋白。在UCP2介导下，脂肪酸阴离子从线粒体内膜的内侧转运到外侧，与质子结合，破坏线粒体膜内外的质子电化学梯度，导致氧化和磷酸化解耦联，最终降低电子渗漏和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生。研究报道，UCP2对急性脑外伤和癫痫损伤具有保护作用，但其是否参与IPC的脑保护作用尚未见报道。本实验首次研究了IPC与UCP2表达的关系，探讨了UCP2在脑缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中的作用。Ghrelin是近年来新发现的一种脑-肠肽，主要在胃合成，还可由海马、丘脑、垂体等组织分泌。Ghelin能促进生长激素的释放、调节能量代谢和胃肠道功能。有文献报道，ghrelin对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。另有研究发现，在脑室内注射人工合成的生长素促分泌素(growth hormone secretagogues，GHSs)hexarelin能减轻新生大鼠大脑皮层、海马和丘脑的缺氧缺血损伤。Ghrelin对缺血再灌注损伤有无保护作用?IPC对ghrelin的产生和释放有无影响?目前均未见报道。本实验首次探讨了ghrelin在脑缺皿预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中所起的作用及其机制。研究目的1．探讨IPC是否通过抑制线粒体途径细胞凋亡减轻海马神经元缺血再灌注损伤。2．探讨UCP2在脑缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中所起作用。3．探讨ghrelin在脑缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中所起作用及其与线粒体UCP2表达的关系。通过这三部分实验研究，以期为深入阐明缺血预处理神经保护作用的线粒体机制提供较新的分子生物学实验依据。材料与方法1．全脑缺血再灌注动物模型的建立选用健康成年雄性Wistar大鼠，参照Pulsinelli的四血管阻断法(4VO)建立全脑缺血模型。具体方法如下：大鼠在1％戊巴比妥钠(40mg／kg)腹腔麻醉下，电凝椎动脉，暴露并游离两侧颈总动脉备用。24h后，用相同的麻醉方法麻醉动物，再次暴露两侧颈总动脉，用无创性动脉夹夹闭两侧颈总动脉8min，松开动脉夹，恢复灌注，造成全脑缺血再灌注损伤。实验过程中动物肛温维持在37℃以上。2．动物分组动物随机分为以下几组：(1)对照组(CON组)：只进行假手术，暴露第一颈椎两侧翼孔及两侧颈总动脉，不电凝椎动脉，也不夹闭颈总动脉造成脑缺血。(2)缺血再灌注组(I／R组)：不接受缺血预处理，只在电凝椎动脉24h后接受一次8min的致死性缺血及72h再灌注。(3)缺血预处理组(PC组)：只给予一次3min的短暂缺血预处理及72h冉灌注，不进行第二次的致死性缺血。(4)缺血预处理+缺血再灌组(IPC+I／R组)：先给予一次3min的短暂缺血预处理，72h后，再给予致死性脑缺血8min及72h再灌注。(5)缺血预处理+SOD组(PC+S组)：PC组大鼠在3min短暂缺血前5min，给予过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，10，000 U／kg)腹腔注射。(6)缺血预处理+生理盐水组(PC+N组)：PC组大鼠3min短暂缺血前5min，给予与SOD相同剂量的生理盐水腹腔注射。(7)缺血再灌注+ghrelin组(I／R+G组)：I／R组大鼠在8min致死性缺血后，立即给予ghrelin(0.4mg/kg)腹腔注射，1次／d，连续3d。(8)缺血再灌注+生理盐水组(I／R+N组)：I／R组大鼠在8min致死性缺血后，立即给予与ghrelin同剂量、同频率的生理盐水腹腔注射。(9)对照+生理盐水组(CON+N组)：只暴露第一颈椎两侧翼孔及两侧颈总动脉，不电凝椎动脉，也不夹闭颈总动脉，每天给予与ghrelin同剂量的生理盐水腹腔注射。3．检测指标与方法(1)采用HE、TUNEL和抗神经元抗体免疫组化染色检测缺血预处理及注射ghrelin后海马CA1区神经元病理组织学改变和细胞凋亡情况。(2)采用RT-PCR检测缺血预处理及注射ghrelin后海马组织UCP2 mRNA表达变化。(3)免疫组化方法检测缺血预处理后海马神经元Bc1-2、Bax、细胞色素C(cytochrome c，Cyt c)和UCP2的表达，以及注射ghrelin后Bc1-2表达变化。(4)Western blot方法检测缺血预处理后海马组织caspase-9表达变化。(5)ELISA法检测缺血预处理对大鼠血浆中ghrelin浓度的影响。4．统计学处理实验数据用均数±标准误((?)±SEM)表示，各组间比较采用单因素方差分析t检验或两因素方差分析t检验，p≤0.05表示差异有统计学意义。结果1．缺血预处理对缺血再灌注后海马CA1区神经元病理组织学和细胞凋亡的影响HE染色结果显示，I／R组海马CA1区神经元大量丢失，大部分细胞出现胞浆固缩，核固缩、碎裂。IPC+I／R组大部分细胞边界清楚，核形状规则，少数细胞出现核染色变深，胞浆部分消失等变性的表现。对照组、I／R组和IPC+I／R组海马CA1区神经元存活数分别为250.5±10.5、30.2±3.8和221.0±8.0／mm，IPC+I／R组较对照组明显降低(p＜0.001)，但明显高于I／R组(p＜0.001)。抗神经元抗体免疫组化染色结果显示，I／R组海马CA1区多数神经元胞浆固缩，染色质聚集。而对照组、IPC+I／R组及PC组同一区域的神经元形态规则，边界清楚。三组海马CA1区存活细胞数分别为231.3±5.2、194.0±10和237.2±12.3／mm，三组间比较无统计学差异；I／R组海马CA1区细胞大量丢失，存活细胞数为41.1±7.7／mm，较上述三组明显减少(p＜0.001)。TUNEL染色结果显示，I／R组海马CA1区多数神经元表现核固缩或染色质边聚。IPC+I／R组只有少量神经元凋亡。对照组、I／R组和IPC+I／R组凋亡细胞数分别为6.8±0.6、137.4±4.5和33.3±6.0／mm。IPC+I／R组凋亡细胞数明显高于对照组(p＜0.01)，但明显低于I／R组(p＜0.001)。2．缺血预处理对海马CA1区神经元线粒体途径凋亡基因表达的影响免疫组化结果显示，与I／R组比较，IPC+I／R组海马CA1区神经元Bc1-2表达明显增强(p＜0.05)，而Bax和Cyt c表达明显减弱(p＜0.05)。Western blot方法检测结果显示，IPC+I／R组海马组织活化caspase-9的表达量明显少于I／R组(p＜0.001)。3．缺血预处理对海马CA1区神经元UCP2表达的影响RT-PCR结果显示，PC组海马组织有大量UCP2 mRNA表达，明显多于其他三组(p＜0.001)；IPC+I／R组和I／R组UCP2 mRNA表达水平相似，并且均明显高于对照组(p＜0.05)。UCP2免疫组化结果显示，对照组、I／R组和IPC+I／R组海马CA1区锥体细胞UCP2表达水平较低，而PC组较其他三组明显增多(p＜0.05)。PC+S组海马CA1区神经元只有少量UCP2表达，明显低于PC组(p＜0.001)和PC+N组(p＜0.01)。4．缺血预处理对血浆中ghrelin水平的影响ELISA法检测结果显示，致死性缺血再灌注24h后，IPC+I／R组血浆ghrelin水平较对照组和I／R组明显升高(p＜0.001)，并且持续72h(p＜0.001)。I／R组各个对应时间点血浆ghrelin水平恒定，与对照组比较无统计学差异。5．Ghrelin对缺血再灌注后海马CA1区神经元损伤的保护作用HE染色结果显示，注射ghrelin后，CON+N组、I／R+N组和I／R+G组海马CA1区神经元存活数分别为251.3±8.7、28.5±7.3和179.5±11.5／mm，I／R+G组明显多于I／R+N组(p＜0.001)，但较CON+N组明显减少(p＜0.001)。TUNEL染色结果显示，CON+N组、I／R+N组和I／R+G组海马CA1区凋亡细胞数分别为7.5±0.9、135.0±5.7和28.7±1.9／mm，I／R+G组凋亡细胞数明显低于I／R+N组(p＜0.001)，但明显高于CON+N组(p＜0.05)。6．Ghrelin对海马神经元UCP2和Bc1-2表达的影响免疫组化结果显示，CON+N组、I／R+N组和I／R+G组大鼠海马CA1区神经元Bc1-2蛋白表达均不明显。RT-PCR结果显示，I／R+G组海马组织有大量UCP2 mRNA表达，明显多于CON+N组、I／R+N组和IPC+I／R组(p＜0.001)，IPC+I／R组和I／R+N组UCP2 mRNA表达水平相似，并且均明显高于CON+N组(p＜0.05)。结论1．大鼠全脑缺血再灌注导致的海马CA1区神经元损伤包括坏死和凋亡。2．缺血预处理可明显减轻缺血再灌注后海马CA1区神经元的损伤。3．缺血预处理能下调Bax表达及上调Bc1-2表达，降低线粒体膜通透性，抑制Cyt c释放和caspase-9前体活化，从而经抑制线粒体途径细胞凋亡，起到减轻海马CA1区神经元缺血再灌注损伤的作用。4．缺血预处理能诱导海马CA1区神经元UCP2的表达，通过保护线粒体功能，减轻缺血再灌注损伤。5．缺血预处理能增加大鼠血浆中ghrelin水平，并通过ghrelin上调海马CA1区神经元UCP2表达，保护线粒体功能，减轻缺血再灌注损伤。6．缺血预处理抗海马神经元缺血再灌注损伤的机制是通过抑制线粒体途径凋亡，促进ghrelin释放，诱导UCP2表达，最终保护线粒体功能而实现的。