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山豆根是最初记载于《开宝本草》的一种中药,前期对山豆根的研究发现其中含有Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,而该类型化合物具有一定的抗肿瘤活性。但是Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物在山豆根中的含量较低,且提取收率低,所以如何大量得到该类型化合物已成为当务之急。本课题对Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的仿生合成方法进行研究,为该类型化合物的深入研究奠定物质基础,后续对该类型化合物的抑制肿瘤活性和选择性进行评价,并对其抗肿瘤机制进行研究,期望发现新的前体化合物或候选药物。目的和意义:通过前期工作,我们发现Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用,研究采用仿生合成的方法来构建合成路线短、反应条件温和、操作简单、收率高的合成工艺,并通过体外活性测定方法来评价其抗肿瘤活性,进而对其抗肿瘤机制进行深入研究。研究方法:首先对Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物进行仿生合成,并对合成工艺条件进行优化;通过MTT法测定Tonkinensine B对不同肿瘤细胞的抑制活性,计算其IC50,确定Tonkinensine B的有效浓度;使用Hoechst33342染色法观察Tonkinensine B引起MDA-MB-231细胞凋亡的形态变化;通过细胞流式技术研究Tonkinensine B促进MDA-MB-231细胞凋亡的作用;使用Western Blot测定MDA-MB-231细胞的内源性细胞凋亡途径中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表达量,从而确定Tonkinensine B对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中关键蛋白表达的影响。研究成果:本实验以N,N-4-二甲基-4-氨基吡啶（DMAP）为催化剂,以（-）-Cytisine和（-）-Maackiain为底物,在HCHO的存在下以温和方式合成了Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,并通过优化反应条件,构建了较优的合成工艺。对（-）-Cytisine、（-）-Maackiain和Tonkinensine B进行体外细胞毒性测定,测定的细胞株包括MCF-7、MDA-MB-231、3LL、9L、Raw264.7、BV2,研究发现Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用,尤其是对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的毒性较明显(IC50=19.2μM)。Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对正常的免疫细胞Raw264.7和BV2细胞的毒性数据表明该类化合物对中枢神经系统具有低的细胞毒副作用;细胞流式实验数据表明Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物促进MDA-MB-231细胞凋亡是发生在细胞凋亡的晚期;Western Blot实验数据表明该类化合物可调控MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表达。所得结论:我们用仿生合成的方法将（-）-Cytisine和（-）-Maackiain偶联合成Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,该类化合物能够有效地降低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的活性,加速细胞的凋亡,并且细胞凋亡是通过线粒体介导的细胞凋亡途径,其具体机制是通过上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,促进Cytochrome C从线粒体向细胞质释放,最终促进细胞凋亡。学术意义与应用前景:乳腺癌是当今临床上常见的一种恶性肿瘤,据统计我国乳腺癌的发病率已经成为女性肿瘤的首位。随着现代免疫学和细胞分子生物学的快速发展,人们对乳腺癌细胞凋亡通路中信号的转导有了深入了解,人体通过细胞凋亡这一生理过程能够有效的抑制肿瘤细胞的生长,因此恶性肿瘤的治疗方法主要是以诱导肿瘤细胞发生凋亡来遏制肿瘤的生长。本课题通过采用仿生合成的方法得到Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,对其抗肿瘤生物活性进行筛选,发现其对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较为明显的毒性作用,我们应用现代生物学技术和分子生物学手段,考察Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用,探讨其促进MDA-MB-21细胞凋亡通路的分子机制,未来有利于阐明乳腺癌的具体发病机制,为开发新的乳腺癌治疗药物提供更多的理论依据。