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植物类甜蛋白(Thaumatin-like protein,TLP)属于PR-5家族,其大多数成员都参与植物对各种生物和非生物胁迫的防御反应。本研究在前期工作基础上,进一步验证TaLr19TLP1基因与小麦抗叶锈病防御反应的相关性,明确了叶锈菌及信号分子诱导下TaLr19TLP1基因的表达模式,及其在小麦根、茎、叶中的表达差异;通过轰击洋葱表皮对该基因进行亚细胞定位;利用病毒诱导的基因沉默(virus induced genesilencing,VIGS)技术对该基因进行了初步的功能验证。具体研究结果如下: 1.应用半定量PCR技术检测叶锈菌诱导后小麦不同组织中TaLr19TLP1基因表达模式。结果表明,TaLr19TLP1基因在茎中表达量最大,其次为叶和根中,在叶中优先达到表达高峰,但表达量仍小于茎。 2.TaLr19TLP1基因表达受脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯等信号分子的不同程度的诱导。明确0.5mmol/L ABA、0.5mmol/L SA、0.05mmol/L ETH、0.1mmol/LMeJA为最佳诱导浓度。乙烯最先诱导该基因表达。SA、MeJA和ABA预处理后不同时间接种叶锈菌,TaLr19TLP1基因表达量明显增加,乙烯略有下降。 3.利用基因枪轰击洋葱表皮细胞,将带有HindⅢ和SacⅠ酶切位点的TaLr19TLP基因和绿色荧光蛋白(GFP)构成的融合蛋白导入洋葱表皮。在pCamA启动子作用下,TaLr19TLP和GFP融合蛋白显著积累在细胞壁和随机分散在胞外区域,说明TaLr19TLP1基因编码胞外蛋白。 4.构建VIGS表达载体,接种携带沉默基因的病毒载体和小麦叶锈菌FHJT后,TcLr19的反应型由“0”变为“2”或“3”,侵染型增高;实时荧光定量分析基因表达量,TaLr19TLP1基因表达水平下降,表明成功沉默TaLr19TLP1基因。 以上研究结果分别从基因表达、亚细胞定位和功能验证等方面证明了TaLr19TLP1基因参与TcLr19应答小麦叶锈菌FHJT防御反应。