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目的:探究利用直接法制备携带精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸—丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)肽段并且可以运载尿激酶(Urokinase,UK)的靶向微泡造影剂的可行性;检测靶向微泡造影剂的一般理化性质;探究影响靶向微泡造影剂携带率的可能因素。方法:(1)用荧光染料FITC对UK进行荧光标记,制成FITC-UK;用荧光染料5-TAMRA对RGDS进行荧光标记,制成5-TAMRA-RGDS。(2)通过直接法配置靶向微泡造影剂,并通过对靶向微泡造影剂外观的观察、PH测定、光学显微镜观察、粒径细胞仪测定等来检测靶向微泡造影剂的一般理化性质。(3)利用流式细胞仪检测荧光标记靶向微泡造影剂中RGDS及尿激酶的携带率,找出可能的相关影响因素。①成分比例及孵育时间的影响:根据成分比例分组,造影剂/尿激酶/RGDS分为A组(1:1:1)、B组(1:2:1)、C组(1:1:2)、D 组(2:1:1)、E 组(2:2:1)、F 组(2:1:2)、G 组(1:2:2)。将不同分组的溶液分别加入5ml试管中,待溶液充分混匀后室温下避光孵育。每个组分为三份。分别孵育0小时、孵育1小时、孵育2小时。用流式细胞仪检测不同组别各样本孵育Oh、孵育1h、孵育2h时UK携带率、RGDS携带率及UK和RGDS双携带率。②加药顺序的影响:实验按照不同的加药顺序分为A组(先加UK组)、B组(先加RGDS组)、对照组(同时加药组)。用流式细胞仪检测不同加药顺序的三组溶液UK携带率、RGDS携带率及UK、RGDS双携带率。③洗涤的影响:将孵育后的7组比例不同的靶向造影剂溶液用悬浮洗涤法洗涤后,用流式细胞仪检测7组不同比例靶向造影剂洗涤后UK携带率、RGDS携带率、UK及RGDS双携带率,并与洗涤前的携带率相比较。结果:(1)配置好的FITC-UK溶液呈鲜亮金黄色,5-TAMRA-RGDS溶液呈鲜亮的深玫红色。(2)携RGDS载尿激酶靶向微泡造影剂的一般理化性质:①肉眼观察配置完成的靶向微泡造影剂,为白色乳状混悬液,静止后可分两层。上层为白色、细腻,大小较均一的微泡,多聚集于试管壁周围。下层为透明略偏白色溶液。轻轻震荡,溶液立刻变为白色乳状混悬液。按声诺维、尿激酶及RGDS不同比例配制的7组靶向微泡造影剂外观均呈粉红色凝乳状,不透明,静置后容易分层,上层为白色、细腻、大小较均一凝乳状的微泡,下层为微浑、半透明的不同鲜亮程度的淡粉红色液体。②声诺维造影剂pH值为6.98。靶向微泡造影剂pH为7.3,中性溶液。③光学显微镜下见靶向微泡造影剂中微泡为中央透光的圆形结构,外有深色膜状壳包裹,分布较集中,大小较均一。④靶向微泡造影剂粒平均粒径大小1415nm,较声诺维造影剂平均粒径有所增大,但仍为纳米级。Zata电位-5.86mv,靶向微泡造影剂溶液带负电荷。⑤声诺维与FITC-UK及5-TAMRA-RGDS以不同比例配置,双荧光标记后的靶向造影剂在荧光显微镜下均能被激发出绿色荧光及红色荧光。(3)携RGDS载尿激酶靶向微泡造影剂携带率的影响因素:①7组不同比例配置的靶向微泡造影剂在不同孵育时间(Oh,1h,2h)所测得UK的携带率差异不具有统计学意义(F时间=2.362,P=0.210);RGDS的携带率的差异不具有统计学意义(F时间=0.530,P=0.640);UK及RGDS双携带率的差异不具有统计学意义(F时间=0.521,P=0.629)。不同成分比例声诺维、UK、RGDS混合制得的靶向微泡造影剂对应的UK的携带率的差异有统计学意义(F分组=11.533,P=0.000)、RGDS的携带率的差异有统计学意义(F分组=18.835,P=0.000)、UK及RGDS双携带率的差异有统计学意义(F分组=8.272,P=.001)。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:1时,UK的携带率最大。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:2时,RGDS的携带率最大。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:1时,UK及RGDS双携带率最大。②加药顺序的影响:不同加药顺序制备出的靶向微泡造影剂UK携带率的差异有统计学意义(F=26.861,P=0.00);RGDS携带率的差异有统计学意义(F=17.392,P=0.00);UK及RGDS双携带率的差异有统计学意义(F=31.240,P=0.00)。对照组UK的携带率高于A组及B组,B组UK的携带率高于A组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。B组RGDS的携带率高于A组及对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。对照组UK及RGDS双携带率高于A组及B组,B组UK及RGDS的双携带率高于A组。差异均有统计学意义(P<0.05)。同时加入UK及RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂的UK携带率、UK及RGDS的双携带率高于其他两种加药顺序配置出的靶向造影剂的UK携带率及双携带率。先加RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂的RGDS携带率高于其他两种加药顺序配置出的靶向造影剂的RGDS携带率。③洗涤对携带率的影响:7组不同比例声诺维、UK、RGDS配制的靶向造影剂在孵育2小时后用悬浮洗涤法洗涤,每组洗涤前后UK携带率、UK及RGDS双携带率的变化差异均有统计学意义(P<0.05),各组洗涤后的UK携带率、UK及RGDS双携带率均低于洗涤前。B组洗涤前后RGDS携带率的差异有统计学意义(P<0.05)A组、C组、D组、E组、F组、G组洗涤前后RGDS携带率的差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:(1)直接法制备携RGDS载尿激酶靶向造影剂的方法可行。(2)声诺维、UK、RGDS三者的成分比例对UK携带率、RGDS的携带率、UK及RGDS双携带率有影响。本次实验最后结果是,在声诺维:UK:RGDE比例为1:2:1配置下的靶向造影剂UK携带率、UK及RGDS双携带率最高。在声诺维:UK:RGDS混合比例为1:2:2时,RGDS的携带率最高。(3)孵育时间对靶向造影剂UK携带率、RGDS的携带率、UK及RGDS的双携带率均无影响。(4)UK及RGDS添加顺序对靶向造影剂UK携带率、RGDS携带率、UK及RGDS双携带率有影响。本次实验结果为同时加入UK及RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂UK携带率、UK及RGDS双携带率高于其他两种加药顺序。先加RGDS的加药顺序配制出的靶向造影剂的RGDS携带率高于其他两种加药顺序。(5)洗涤对UK携带率、UK及RGDS双携带率有影响。洗涤后UK携带率、UK及RGDS双携带率均降低,间接表明了直接法制备的靶向造影剂的稳定性较差,当遇到水流等冲击,造影剂上所载药物容易脱落。