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研究背景:周围神经损伤是骨科临床工作中的常见病与多发病,最常见的是外伤直接导致的神经损伤。周围神经系统拥有内源性的修复和再生潜力,严重的外周神经的断裂导致轴突变性和中枢神经元死亡,实现局部神经组织再生和功能重建依然十分困难。神经损伤后,显微外科直接缝合治疗是常用的治疗手段;当神经缺损段距离过长时就需要自体神经移植或者人工神经导管桥接修复。周围神经修复包含一系列复杂的细胞和分子调节过程,单纯的手术修复无法解决所有的问题。手术修复损伤周围神经虽然实现了局部的重新连接,但残留的神经疼痛,远端神经功能恢复不良,给患者个人带来深远的影响,给正常的工作生活带来极大的困难。当前干细胞治疗在再生医学领域应用广泛,干细胞在周围神经损伤中的应用也展示出巨大的潜力。近年来,许多研究工作显示大脑多巴胺能神经营养因子(CDNF)具有中脑神经元保护作用;在大鼠坐骨神经损伤模型中,直接应用慢病毒载体过表达CDNF可以改善大鼠下肢功能的恢复。当前任何一种方法的单独应用都无法满足损伤神经功能重建的要求,联合治疗为神经再生提供了新的方向。研究目的:本实验通过首先提取并鉴定大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs),使用慢病毒载体转染,建立能持续表达CDNF的细胞载体。在大鼠的坐骨神经桥接模型中局部应用干细胞治疗载体,探讨联合应用人工胶原导管和转染脑多巴胺能神经营养因子基因的大鼠骨髓间充质干细胞的治疗策略对损伤局部神经的再生,中枢神经元的存活和远端靶器官的影响,评估联合治疗策略对周围神经再生的作用。研究方法:体外实验(1)骨髓间充质干细胞的鉴定取成年大鼠的双侧股骨,使用骨髓腔冲洗提取大鼠的骨髓间充质干细胞;取培养的第三代细胞使用流式细胞仪鉴定CD29和CD90的表达。(2)慢病毒载体的转染与检测取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞,使用包含CDNF的慢病毒载体转染。观察转染细胞状态,培养2周,使用Western blot检测骨髓间充质干细胞中CDNF的蛋白表达。体内实验(1)制作大鼠神经坐骨神经缺损模型应用转染CDNF的慢病毒载体的大鼠MSCs于神经损伤模型中,观察胶原导管联合CDNF对坐骨神经修复的影响。(2)检测CDNF在大鼠坐骨神经中的表达4周后,取桥接区域远端lcm的坐骨神经,液氮保存,Western blot检测各组CDNF的表达量。(3)辣根过氧化物酶(HRP)标记的坐骨神经逆行示踪12周后,每组大鼠随机取4只并增加3只正常大鼠为对照在神经桥接区域远端注射辣根过氧化物酶进行神经逆行示踪。再生效果评价(1)坐骨神经新生段的组织学分析应用免疫组化染色技术,取神经再生段染色S100和NF200,光镜下形态学分析显示桥接区域髓鞘和轴突的再生。(2)电镜分析导管和再生神经的局部结构在术后8、12周,使用扫描电镜观察人工胶原导管,监测导管在体内的降解;透射电镜观察坐骨神经再生段,定量分析再生轴突数量和髓鞘厚度。(3)中枢存活神经元的计数HRP逆行示踪术后3天,取大鼠脊髓L4-5染色后,对HRP阳性神经元的数量进行统计分析。(4)坐骨神经指数(SFI)检测术后2、4、6、8、10、12周,对大鼠进行步态记录,并分析大鼠足迹,计算SFI。(5)腓肠肌的恢复检测在术后4、8周,取术侧和正常侧腓肠肌称重,计算肌肉比值。固定肌肉组织进行Masson染色,检测腓肠肌的恢复。研究结果:(1)大鼠MSCs同时表达CD29和CD90.重组CDNF的慢病毒载体感染大鼠MSC培养2周后CDNF蛋白表达量增加,对照组未检测到CDNF蛋白。(2)在手术后4周,在CDNF-MSCs应用组CDNF蛋白表达量增加,而应用LV-MSCs,MSCs和DMEM组表达量较低。(3)在4周和8周和12周时间点,扫描电镜显示胶原神经导管在大鼠体内逐渐降解,管壁的厚度随时间逐渐变薄。(4)在手术后4、8和12周时间点,相对于LV-MSCs组、MSCs组和naive组CDNF-MSCs组的S100和NF200免疫组化显示在形态学上表现出更好的神经再生。(5)在8周和12周时间点,透射电镜下CDNF-MSCs组轴突直径和髓鞘厚度坐骨神经指数,显示出良好的髓鞘成熟度。(6)SFI的分析结果显示CDNF-MSCs应用组,大鼠后肢神经功能出现明显的恢复。(7)HRP神经逆行示踪结果显示,CDNF-MSCs应用促进了损伤后中枢神经元的存活。(8)在术后8周和12周,相对于No repair组,LV-MSCs组,MSCs组和DMEM组,CDNF-MSCs应用组肌肉湿重明显增加。CDNF-MSCs组的肌肉湿重比值显著优于No repair 组,LV-MSCs 组,MSCs 组和 DMEM 组.研究结论:我们的研究表明神经导管内应用结合重组CDNF慢病毒载体的MSCs,具有多重治疗效果:(1)在神经损伤的局部可以有效促进损伤局部的轴突和髓鞘的再生,提高髓鞘的成熟度;(2)在脊髓,可以保护中枢运动神经元的存活;(3)在损伤神经远端靶器官,可以明显减轻腓肠肌的萎缩;(4)明显提高大鼠损伤侧下肢运动功能的恢复。神经导管与CDNF基因治疗和细胞治疗联合起来为治疗周围神经损伤提供了一种新的治疗策略。