论文部分内容阅读
研究背景:随着生活水平的不断提高,国民对酒精的消费日益增加,饮酒人群的消化道疾病发病率明显高于非饮酒人群,饮酒导致的急性胃溃疡与胃粘膜损伤性疾病的发病人数日益增高,胃粘膜是胃的重要生理屏障,胃粘膜损伤是多种胃病的首发环节。中医药治疗胃粘膜损伤性疾病历史悠久,临床经验丰富,具有一定的优势和特色,研究乙醇相关胃粘膜损伤的中医药防治方法能够解决现实的临床需求。作为经典补气类中药,黄芪治疗脾胃系统疾病古已有之,如以黄芪为主药的黄芪建中汤,补中益气汤等能治疗腹痛、腹泻、痞满等病证。作为黄芪内含的主要生物活性物质,黄芪甲苷具有多重的生物功能,包括调节免疫、强心、抗病毒、降糖、抗衰老、抗肿瘤等。课题组的前期研究表明,黄芪苷类对胃粘膜损伤具有很好的保护作用,黄芪甲苷与黄芪总苷可以促进乙醇诱导的人胃上皮细胞GES-1损伤的修复。因此,本文在前期研究的基础上,运用动物模型,探讨黄芪甲苷保护乙醇性胃粘膜损伤的作用途径及其内在的分子机制。目的:观察黄芪甲苷对乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤的保护作用,探讨黄芪甲苷在保护乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤过程中的抗炎作用、抗线粒体氧化应激作用及抗细胞凋亡作用及其机制。方法:1、黄芪甲苷对乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤的保护作用研究。建立乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤及黄芪甲苷腹腔注射干预模型,雄性SD成年大鼠,按体重随机区组分为7组:1)正常组、2)模型组、3)溶剂组、4)AS-Ⅳ 4(高剂量4mg/kg)组、5)AS-Ⅳ 2(中剂量2mg/kg)组、6)AS-Ⅳ 1(低剂量1mg/kg)组、7)OME(奥美拉唑阳性药)组,每组8只。正常组、模型组、溶剂组予生理盐水,AS-Ⅳ 4组、AS-Ⅳ 2组、AS-Ⅳ 1组分别予黄芪甲苷注射液4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg,奥美拉哩组予奥美拉唑注射液40mg/kg,连续腹腔注射干预4d,1次/天。第3天干预后大鼠禁食不禁水,第4天干预后禁水,75min后除正常组外各组予无水乙醇灌胃(5ml/kg),正常组予同等量的生理盐水灌胃,1h后脱颈处死,开腹取胃,沿胃大弯剪开,盐水浸洗后肉眼观察胃粘膜损伤情况,并用电子卡尺对损伤部位进行测量,按Guth法计算胃粘膜损伤分数;取各组相同部位的胃粘膜组织进行病理染色观察组织损伤情况。2.黄芪甲苷在保护乙醇诱导的胃粘膜损伤过程中的抗炎作用研究。运用乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤及黄芪甲苷腹腔注射干预模型,取各组大鼠相同部位胃组织,匀浆后检测MPO活力及炎症因子TNF-α、IL-1 β、IL-10的含量,并检测炎症相关蛋白NF-κ B p65的表达情况。3、黄芪甲苷在保护乙醇诱导的胃粘膜损伤过程中的抗线粒体氧化应激作用研究。运用乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤及黄芪甲苷腹腔注射干预模型,取各组大鼠相同部位胃粘膜组织,运用线粒体分离纯化试剂盒提取纯化胃组织细胞线粒体,并以线粒体为研究对象,运用免疫荧光法及比色法检测线粒体氧化应激指标SOD活力及GSH、MDA的含量。4、黄芪甲苷在保护乙醇诱导的胃粘膜损伤过程中的抗细胞凋亡作用研究。运用乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤及黄芪甲苷腹腔注射干预模型,取各组相同部位胃组织,TUNEL染色观察细胞凋亡情况;运用免疫印迹法检测各组胃组织细胞胞浆中凋亡相关因子Bid、AIF、细胞色素C的表达情况;运用比色法检测各组胃组织胞浆中Caspase3、Caspase9的活力;运用RT-PCR法检测胃组织凋亡相关基因Bid mRNA、Cyt-C mRNA、AIFmRNA、Bcl-2mRNA、BaxmRNA的表达情况;提取胃组织细胞线粒体,检测各组线粒体凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达情况及线粒体膜电位的变化。结果:1.大鼠胃粘膜经乙醇刺激后损伤严重,粘膜表面多呈暗红色,并可见条索状、线状、点状出血;病理学显示模型大鼠胃粘膜组织损伤明显,上皮细胞固有层分离、组织坏死、水肿、出血,粘膜细胞出现核固缩甚至溶解,粘膜下层腺体损伤且排列不规则、毛细血管扩张、压缩;模型组与溶剂组胃粘膜损伤程度无差异;胃粘膜损伤Guth评分及光镜下损伤分数比较,AS-Ⅳ 4组、AS-Ⅳ 2组明显低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05),AS-Ⅳ 1组与模型组比较无明显差异。2.乙醇诱导损伤的大鼠胃组织中MPO活力及炎症因子TNF-a、IL-1β浓度高于正常组,IL-10浓度低于正常组,NF-κBp65蛋白较正常组表达升高;溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组、AS-Ⅳ 2组、AS-Ⅳ 1组MPO活力较模型组降低(P＜0.05);AS-Ⅳ 4 组、AS-Ⅳ 2 组 TNF-a、IL-1β 浓度较模型组降低(P＜0.05),AS-Ⅳ 1 组TNF-a、IL-1β浓度与模型组比较无差异;AS-Ⅳ 4组IL-10含量较模型组升高(P<0.05),AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ1组IL-10含量与模型组比较无差异。3.乙醇诱导的胃粘膜损伤大鼠胃组织细胞线粒体SOD活力及GSH含量下降、MDA含量上升(P＜0.05);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组较模型组相比GSH含量升高(P＜0.05),AS-Ⅳ 2组及AS-Ⅳ 1组GSH含量与模型组比较无差异;AS-Ⅳ 4组、AS-Ⅳ 1组较模型组相比MDA含量下降(P<0.05),AS-Ⅳ 2组MDA含量与模型组比较无差异;各给药组较模型组相比,SOD活力无明显差异。4.TUNEL染色显示模型组大鼠胃组织细胞凋亡率明显高于正常组(P＜0.01);溶剂组与与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组、AS-Ⅳ 2组胃组织细胞凋亡率较模型组明显降低(P<0.05);AS-Ⅳ 1组与模型组比较无显著差异。乙醇诱导的胃粘膜损伤大鼠胃组织细胞胞浆中Caspase 3和Caspase 9活力显著升高(P<0.01),溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组、AS-Ⅳ 2组及AS-Ⅳ 1组Caspase-9活力较模型组均明显降低(P<0.05);AS-Ⅳ 4组、AS-Ⅳ 2组Caspase-3活力较模型组显著降低(P<0.01),AS-Ⅳ 1组与模型组比较无差异。乙醇诱导的胃粘膜损伤大鼠胃组织细胞线粒体膜电位明显下降;AS-Ⅳ 4组较模型比较,线粒体膜电位明显升高(P<0.05)。5.乙醇诱导的胃粘膜损伤大鼠胃组织细胞胞浆Bid蛋白表达明显减少(P<0.01),AS-Ⅳ 4组与模型组比较Bid蛋白的表达显著升高(P<0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1组与模型组比较无差异。Cyt-C的表达模型组明显高于正常组(P＜0.01);模型组与溶剂组无差异;AS-Ⅳ 4、AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1组均能不同程度的减少Cyt-C的表达(P<0.01)。模型组AIF蛋白的表达显著高于正常组(P<0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4及AS-Ⅳ 2组均能降低AIF的表达(P＜0.05);AS-Ⅳ 1组与模型组比较无差异。线粒体蛋白Bax的表达模型组显著高于正常组(P<0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4、AS-Ⅳ2、AS-Ⅳ 1组均能不同程度的降低Bax的表达(P＜0.05)。模型组线粒体膜蛋白Bcl-2表达明显低于正常组(P<0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组与模型组比较Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.01);AS-Ⅳ 2组与AS-Ⅳ1组与模型组比较无明显差异。6.乙醇诱导的胃粘膜损伤大鼠胃组织BidmRNA表达显著升高(P＜0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组与模型组比较BidmRNA表达明显下降(P＜0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1组与模型组无差异。模型组Cyt-CmRNA表达明显高于正常组(P＜0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组较模型组比Cyt-C mRNA表达显著下降(P<0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ1组与模型组无差异。AIF mRNA的表达模型组显著高于正常组(P＜0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组能显著下调AIFmRNA的表达(P<0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1组与模型组无差异。经乙醇刺激后,大鼠胃组织Bax mRNA的表达显著升高(P<0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组较模型组比Bax mRNA表达明显下降(P<0.05);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1组与模型组比较无差异。Bcl-2 mRNA的表达模型组较正常组显著下降(P<0.01);溶剂组与模型组无差异;AS-Ⅳ 4组能显著上调Bcl-2 mRNA的表达(P＜0.01);AS-Ⅳ 2、AS-Ⅳ 1组与模型组比较无差异。结论:1.乙醇诱导的胃粘膜损伤过程中,大鼠胃组织细胞发生了线粒体氧化应激及线粒体途径的细胞凋亡;黄芪甲苷能够通过减少线粒体脂质过氧化,增加线粒体GSH浓度减轻线粒体氧化应激反应。2.乙醇诱导胃粘膜损伤过程中,大鼠胃组织发生了以中性粒细胞聚集、促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β高表达、抑炎症细胞因子IL-10低表达、炎症反应关键蛋白NF-κB p65高表达为特征的炎症反应;黄芪甲苷能够通过降低MPO活力、减少TNF-α、IL-1β及NF-κBp65的表达,增加IL-10的表达减轻胃组织的炎症反应。3.黄芪甲苷腹腔注射具有保护乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤的作用,这种作用可能与其抗因炎症及线粒体氧化应激诱导的大鼠胃组织细胞凋亡有关。