论文部分内容阅读
胆管癌(Cholangiocarcinoma)是指原发于左右肝管汇合部至胆总管下端的肝外胆管恶性肿瘤，胆管癌的发生率逐年增高，但由于缺乏特异性的临床表现和诊断指标，早期诊断率低下，目前尚缺乏有效治疗于段。现阶段的临床应用药物对胆管癌敏感性欠佳，且存在明显毒副作用，因此深入了解胆管癌的发病和耐药机制，寻求更敏感、有效的药物，对提高胆管癌药物治疗的疗效十分必要。Compound K(20-O-beta-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol,CK），是二醇型人参皂甙在肠道细菌作用下的最终代谢产物。我们前期研究证实，CK对胃癌、肝癌、肠癌、胆管癌等多种肿瘤具有很好的抑制作用。间充质干细胞(mesenchymalstem cells，MSCs)是具有多向分化潜能的非造血干细胞，除了具有造血支持、免疫调节和多向分化等特性外，还具有特异性地迁移到损伤部位和肿瘤组织的特性，继而对肿瘤的发生发展起调控作用。目前的研究表明，MSCs对不同的肿瘤细胞或同一种肿瘤细胞可能起不同的调控作用。本课题是在抗癌药物CK干预下，研究MSCs对胆管癌细胞增殖、侵袭和耐药的影响及其作用机制。
本研究是通过胶原酶消化法在人脐带中成功分离、纯化了MSCs。以人胆管癌细胞系QBC939、Mz-Cha-1及裸鼠荷胆管癌模型为研究对象，采用直接共培养、间接共培养、以及收集MSCs条件培养基(Condition Medium，CM)等方法作用于研究对象。首先，通过MTS法测定了两种细胞系在CM存在和不存在两种情况下经不同浓度CK的处理24 h后细胞的增殖存活率。结果表明，CK对QBC939和Mz-Cha-1细胞具有明显的存活抑制作用，它们的增殖存活率与CK呈剂量-时间依赖关系。进一步发现当有CM存在的情况下，CK的作用减弱。比较两组最高浓度CK的抑制率发现CM组CK的抑制率小于对照组(p＜0.05)，说明CM可以在一定程度上拮抗CK的抗癌作用，提高胆管癌细胞对CK的耐受性。随后，通过Annexin V/PI双染，经流式细胞仪检测得到了相似的结果，CM能够减弱CK的诱导QBC939和Mz-Cha-1细胞的凋亡。同时，我们还采用了Transwell和克隆形成的方法检测了MSCs对QBC939和Mz-Cha-1细胞的侵袭和克隆形成能力，结果显示，CK可有效抑制QBC939和Mz-Cha-1细胞的侵袭和克隆形成，但这一抑制现象也被MSCs在一定程度上逆转。
为了进一步阐明MSCs促进QBC939和Mz-Cha-1细胞增殖、侵袭转移和逆转CK作用的分子机制，我们首先采用荧光素酶双报告基因的方法检测MSCs对Wnt活性的影响，结果证明MSCs对Wnt活性有显著的激活作用(p＜0.01)，而CK则能明显拮抗MSCs对Wnt的激活(p＜0.05)。接着，我们用Western Blotting的方法对经不同处理组的QBC939和Mz-Cha-1细胞全蛋白进行分析，结果表明CM能够促进QBC939和Mz-Cha-1两种细胞系的β-catenin蛋白表达增加，β-catenin的下游靶蛋白MMP2，c-Myc的表达也被上调。综合前面Wnt活性测定结果，提示我们CM促进胆管癌细胞增殖、侵袭转移可能是通过Wnt/β-catenin途径。因此，我们继续采用免疫荧光和分离细胞核蛋白、细胞质蛋白经WesternBlotting分析相结合的方法研究CM对β-catenin在胆管癌细胞内亚定位影响。结果显示，在QBC939和Mz-Cha-1细胞质内β-catenin受CM影响转位到细胞核，从而使细胞核内的β-catenin增多，继而调控下游的增殖转移相关蛋白，促进胆管癌细胞的增殖、侵袭转移。另外，我们还通过胆管癌芯片分析了40例人胆管癌组织中β-catenin以及c-Myc的表达。分析发现，c-Myc的表达与年龄、肿瘤病理分期、浸润深度、淋巴结转移等均无相关性，而β-catenin与其中的肿瘤病理分期有相关性，肿瘤分期越高，β-catenin表达越高。这一结果提示我们β-catenin在胆管癌的发生发展中可能起着重要的作用，为我们接下来的研究提供了有力的依据。
最后，我们采用裸鼠皮下成瘤模型，结果证实MSCs及其条件培养基可以在裸鼠体内有效的促进QBC939细胞的增殖生长，且促进其向肝脏转移。免疫组化对裸鼠移植瘤组织分析，得出，MSCs组的β-catenin，cyclinD1，和KI-67的表达较对照组有明显增多。CK同样在体内有效抑制了胆管癌细胞QBC939细胞的增殖生长和肝转移。综上所述，本论文的研究结果证实了MSCs及其条件培养基具有促进人胆管癌细胞增殖、侵袭转移的能力和对抗癌药物CK的耐受性，并初步证实MSCs及其条件培养基促进人胆管癌发生发展与Wnt/β-catenin通路密切相关。这些结果不仅可以为更加详细地揭示MSCs促进人胆管癌细胞增殖、侵袭转移和耐药的分子机制提供线索，而且能为临床上胆管癌的治疗提供新思路和作用靶点。同时也为间充质干细胞与肿瘤的关系的研究提供新证据。