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Toll样受体(Toll like receptor, TLRs)是一种介导天然免疫和获得性免疫的病原模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs),能识别表达在病原微生物上的高度保守的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs),并将信号向下游传递,启动和调节机体的免疫反应。目前TLR4已成为TLRs家族之中研究最热门的成员之一。TLR4作为动物疾病易感性相关的候选基因,已被广泛认可。且最近研究发现在猪、绵羊、小鼠等生物上存在TLR4基因的可变剪接体,而在鸭上是否也同样具有可变剪接的形式,TLR4功能又如何,目前尚未见有报道。本研究通过克隆、鉴定鸭TLR4基因及其可变剪接体,利用qRT-PCR分析各可变剪接体在鸭组织及在LPS刺激鸭胚成纤维细胞前后表达变化,确定主要剪接形式。并构建pcDNA3.1+-TLR4过表达载体,瞬时转染到鸭胚成纤维细胞,利用polyI:C和LPS模拟病毒和细菌来建立病毒和细菌感染模型,探讨TLR4信号通路中IL-1β、IL6和MHCⅡ等相关基因表达变化,研究旨在初步探明鸭TLR4基因可变剪接形式的存在性,及阐述主要剪接形式的结构和表达特征,初步阐明TLR4基因在鸭抵抗细菌感染和病毒感染中的功能,为今后研究禽类天然免疫奠定基础,同时也为培育天然抗病鸭品种提供基因资源。1.本研究利用RT-PCR和LD-PCR技术,获得了鸭TLR4基因CDS序列以及DNA序列全长,结果发现,duTLR4基因长为2532bp,包含3外显子和2内含子,并获得鸭TLR4基因一种新的可变剪接体(TLR4b),长为3367bp,经鉴定其剪接形式为跨内含子剪接。2.采用qRT-PCR检测两种可变剪接体在各组织中的表达,结果发现在胸腺、肺、脾脏、肝脏、肾脏等组织中,TLR4a基因的表达量都远高于TLR4b。通过构建LPS感染鸭胚成纤维细胞(DEF)模型,利用qRT-PCR方法检测TLR4a、TLR4b基因在空白组、LPS感染处理组不同感染点的mRNA表达量,结果表明,TLR4基因的表达主要以TLR4a为主,且在LPS抗原刺激后,DEF细胞中TLR4a mRNA表达量总体表现为先上升,后下降,而TLR4b表达总体变化不大,表明TLR4其功能主要取决于TLR4a。3.为了进一步探讨duTLR4a功能,构建了pcDNA3.1+-TLR4真核表达载体,瞬时转染入DEF,经LPS和polyI:C刺激后,qRT-PCR检测结果显示,在LPS和polyI:C刺激12h内,IL-1β、IL6和MHCⅡ表达量都升高,且具有时效关系。为进一步验证TLR4a在抗病毒感染中作用,通过构建PolyI:C感染雏鸭活体模型,利用qRT-PCR方法检测TLR4a mRNA不同组织中的的表达量,结果表明,在polyI:C等抗原刺激后,肺、脾脏等组织中TLR4a mRNA表达量总体表现为先上升,后下降。实验结果进一步证实了duTLR4不仅在机体抗细菌感染发挥作用,而且在抗病毒感染过程同样发挥了重要作用。