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研究背景:急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL）是一类基因背景高度异质性的血液系统恶性克隆性疾病,是儿童常见的恶性肿瘤。随着ALL的治疗方法不断更新完善,ALL患者的生存率得到了长足的提高,但仍有相当一部分患者在治疗中发生耐药、复发。糖皮质激素是治疗ALL的主要药物之一,应用于ALL不同化疗方案之中。对糖皮质激素治疗反应性是ALL治疗疗效的独立预后因素[1]。糖皮质激素耐药是ALL治疗失败的重要因素,关于糖皮质激素耐药机制尚不明确,已有报道发现儿童ALL患者化疗后复发时特异性获得NR3C1基因缺失[2]。本课题组在前期研究中,首次利用全基因组外显子测序技术筛选出成人ALL发生异基因造血干细胞移植后复发时,复发白血病细胞特异性获得糖皮质激素受体编码基因-NR3C1的缺失突变（使蛋白合成提前终止）,且突变位点位于蛋白的糖皮质激素受体功能区域（exon2:c.431<sub>431delinsAG（p.D144Efs×11））[3]。本研究在前期研究基础上进一步围绕NR3C1基因突变,通过体外细胞实验研究明确NR3C1基因突变对糖皮质激素受体蛋白功能、糖皮质激素促白血病细胞凋亡信号通路的影响,及诱导ALL耐药的分子机制。目的:本研究为明确NR3C1基因突变对NR3C1蛋白生物学功能的影响,探讨NR3C1基因突变致ALL耐药的可能机制,为ALL耐药探索有效的干预治疗靶点。方法:（1）用 CCK8 法检测 ALL 细胞株（Reh、Jurkat、CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6）在地塞米松（Dexamethasone，DEX）不同药物浓度（0.1umol/1、0.5umol/l、1.0umol/l、2.5 umol/1、5 umol/1）作用 24h、48h 的细胞增殖率;利用免疫蛋白印迹技术（western blot）、荧光定量PCR技术检测ALL细胞株内源性NR3C1表达情况,分析ALL细胞株内源性NR3C1表达与对地塞米松敏感性的关系。（2）采用慢病毒转染的方式使得ALL耐药株过表达NR3C1蛋白,利用流式细胞术以及CCK8法分别检测过表达NR3C1的ALL耐药株在luM DEX作用48h后的凋亡率和细胞增殖率,明确NR3C1是否能够逆转ALL细胞株耐药性。（3）采用CRISRP/CAS9技术靶向敲除ALL敏感株的NR3C1基因的第二号外显子,利用流式细胞术以及CCK8法分别检测ALL敏感株在NR3C1敲除后对luMDEX作用48h后的凋亡率和细胞增殖率,进一步明确NR3C1表达与ALL细胞株对地塞米松敏感性的关系。（4）耐药ALL细胞株Reh分别转染NR3C1基因野生型（Reh-WT）和质粒空载体（Reh-vector）,用1umol/lDEX作用48h,提取总RNA,进行文库构建及库检。文库质控合格后,进行全基因转录组水平测序,将原始测序数据经过过滤后得到的数据进行生物信息分析。（5）过表达NR3C1以及敲除NR3C1的ALL细胞株在luM DEX处理48h后,利用western blot技术检测其PI3K→AKT→GSK3β信号通路相关蛋白以及BCL-2家族前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达情况。统计学方法:应用SPSS 20.0软件统计分析数据,所有实验进行至少三次生物学重复,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用多重方差分析,计量资料均以（X±S）表示。检验水准α=0.05,双侧检验。结果:（1）通过CCK8法发现,ALL细胞株Reh、Jurkat对DEX耐药,而CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6细胞对DEX敏感,呈剂量和时间依赖。此外,western blot技术、荧光定量PCR技术检测发现,Reh、Jurkat细胞内源性NR3C1低表达,CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6细胞高表达内源性NR3C1。结果提示细胞内源性NR3C1表达与ALL DEX敏感性正相关。（2）过表达NR3C1可以增强ALL耐药株对地塞米松的敏感性。在1umol/lDEX作用48h后,过表达NR3C1的Reh细胞组（Reh-WT）较阴性对照组（Reh-vector）的细胞增殖率明显降低（0.6467±0.03215,1.06±0.19123;p<0.05）、细胞凋亡率明显增高（33.6%±0.34641%，6.5%±0.17321%;p<0.001）;同样,过表达 NR3C1的Jurkat细胞组（Jurkat-WT）较阴性对照组（Jurkat-vector）的细胞增殖率明显降低（0.45±0.0721,0.9733±0.00577;p<0.001）、细胞凋亡率明显增高（57.4%±0.8888%,4.2333%±0.3214%;p<0.001）。（3）NR3C1 基因敲除可以使得ALL敏感株获得对地塞米松的耐药性。在lumol/lDEX作用48h后,敲除NR3C1基因的CCRF-CEM（KO组）较阴性对照组（WT组）细胞增殖率明显增高（0.93±0.12vs0.15±0.04;p<0.001）、细胞凋亡率明显降低（5.1±1.7%vs 79.4±15.4%;p<0.001）;6T-CEM细胞KO组较WT组细胞增殖率明显增高（0.95±0.055 vs0.16±0.006;p<0.001）、细胞凋亡率明显降低（2.05±1.2%vs 67.4±4.2%;p<0.001）;Nalm6细胞KO组较WT组细胞增殖率明显增高（0.91±0.11 vs0.21±0.007;p<0.001）、细胞凋亡率明显降低（3.2±1.5%vs 67.8±0.5%;p<0.001）。（4）耐药ALL细胞株Reh分别转染NR3C1基因野生型（Reh-WT）和质粒空载体（Reh-vector）,用1umol/1 DEX作用48h后,全基因转录组水平测序结果,以Reh-vector组作为对照组,Reh-WT组PI3K相关基因 PIK3CD 下调,PIK3R6、PIK3R5、PIK3R2 基因上调,AKT3、GSK3β上调,前凋亡蛋白相关基因BCL2L11（编码Bim蛋白）、BMF、BOK上调,抗凋亡蛋白相关基因BCL2（编码Bcl-2蛋白）、BAG2下调。（5）过表达NR3C1以及敲除NR3C1基因的ALL细胞在1umol/l地塞米松作用48h后,利用western blot检测发现,过表达NR3C1可以激活ALL细胞的PI3K→AKT→GSK3β信号通路,促进BCL-2凋亡家族的前凋亡蛋白（Bad、Bim）表达,抑制抗凋亡蛋白（BCL-2、BCL-XL）表达。敲除NR3C1后可以逆转这一现象。结论:（1）ALL细胞株内源性NR3C1表达与ALL对糖皮质激素的敏感性呈正相关;（2）过表达NR3C1可以逆转ALL耐药株对地塞米松的耐药性;（3）敲除NR3C1使ALL敏感株获得对地塞米松的耐药性;（4）NR3C1通过激活PI3K→AKT→GSK3β信号通路、促进BCL-2促凋亡蛋白（Bad、Bim）表达、抑制BCL-2抗凋亡蛋白（BCL-2、BCL-XL）表达,从而参与ALL细胞对糖皮质激素耐药。