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第一部分HDM刺激小鼠肺SMAD蛋白表达目的:探讨屋尘螨(HDM)气道刺激后,不同遗传背景小鼠肺组织SMAD蛋白表达有何不同。方法:将A/J和C3H小鼠分别用HDM气道刺激,在最后一次刺激16小时后,取肺组织,经过匀浆处理,提取核蛋白,用western blot免疫印迹法检测肺组织蛋白中Smad2/3、Smad6的表达。结果: A/J和C3H小鼠在HDM气道刺激16小时后,肺组织Smad6蛋白表达差异明显,表现为A/J小鼠Smad6升高,而C3H则呈现于A/J相反得变化,Smad6表达降低,而Smad2/3表达则正好相反,A/J降低,C3H增高。结论:经HDM气道刺激后,不同遗传背景小鼠Smad表达有所差异,需要进一步研究验证其在TGF-β信号传导中的作用。第二部分针对小鼠Smad6基因的RNA干扰目的:针对目的基因Smad6 CDS区设计siRNA序列,构建表达载体,探讨感染后BMDC细胞中Smad6基因和蛋白表达状况。方法:针对目的基因Smad6 CDS区设计三条siRNA序列,分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3 ,使用siRNA质粒表达载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector进行siRNA表达载体构建,对构建成功的siRNA重组表达载体进行去内毒素质粒DNA抽提,siRNA重组表达载体DNA转染L929细胞,然后Real-time PCR的方法检测基因干预后L929细胞中Smad6基因表达状况,使用Lentivirus Pakage systerm进行慢病毒颗粒的包装和生产,测定病毒滴度(梯度稀释法),再分离C3H/HeJ小鼠骨髓原代BMDC,获取最佳MOI值以及感染条件,后用慢病毒感染BMDC细胞,RT-PCR和western blot分别检测感染后细胞中Smad6基因的表达及SMAD6蛋白表达状况。结果: Real Time-PCR检测结果显示,siRNA1对于Smad6基因的沉默效果最好,沉默效率约为67%。考虑到细胞大约75%的转染效率,实际的基因沉默可能达到90%(mRNA),最佳MOI值为20,Real Time-PCR检测结果显示,通过病毒载体感染BMDC细胞,提示siRNA1对于Smad6基因的沉默效约为85%,而BMDC中蛋白表达被明显抑制,与对照组有差异有显著性。结论:我们针对目的基因Smad6 CDS区所设计的siRNA序列而构建的表达载体能成功有效抑制Smad6基因和蛋白表达,为后一步的试验打下了基础。