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H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国,严重威胁着家禽的健康。我国20世纪末就开始使用H9N2亚型AIV灭活疫苗。然而,一旦H9N2亚型AIV抗原发生变异或重组,现有疫苗与新毒株抗原性不匹配,就需要筛选新的疫苗株,这个过程耗时费力,且几乎每隔2-5年就需要更新疫苗。因此具有交叉保护效果的通用疫苗的开发成为目前流感疫苗研究的一个热点,例如设计针对流感病毒保守区域的疫苗、马赛克（Mosaic）疫苗等。Mosaic序列是在不改变目标蛋白长度和特性的前提下,将已有的目标蛋白序列中含有的抗原表位镶嵌组合成的新序列,使其包含更多的来自已有序列的潜在T细胞抗原表位。Mosaic序列的设计是利用已有蛋白质的片段使用遗传算法（计算优化方法）进行组装,产生的序列类似于已有序列。依据Mosaic序列设计的艾滋病毒疫苗、H5亚型禽流感病毒疫苗等均获得较好的通用保护效果。本论文初步研究了Mosaic序列在H9亚型禽流感病毒灭活疫苗中的应用效果。一、H9 AIV的马赛克HA序列（HAm/H9）设计与分析设计合成了一条H9N2 AIV的HA蛋白马赛克序列（HAm/H9）。对HAm/H9进行了抗原表位覆盖率分析;选取处于不同进化分支的H9N2 AIV分离株的HA蛋白序列,与HAm/H9序列进行遗传进化和同源性分析,预测了HAm/H9的B细胞和T细胞抗原表位。结果表明,HAm/H9蛋白序列具有较好的潜在抗原表位覆盖率;其属于Y280这一分支,与其他毒株的同源性范围为86%-100%;HAm/H9的T细胞和B细胞表位多于其他比对毒株。二、表达HAm/H9蛋白的重组H9N1 AIV的拯救以H1N1流感病毒PR8株为骨架,采用反向遗传操作技术,以HAm/H9序列替换PR8株的HA序列,构建获得HAm/H9的表达质粒PHW2000-HAm/H9。采用“7+1”反向遗传操作,将PHW2000-HAm/H9与表达PR8其他7个基因的表达质粒（除HA外）共转染293T和MDCK混养细胞中,拯救并获得了重组H9N1亚型禽流感病毒株rPR8-HAm/H9。测定了重组病毒和亲本PR8株在BHK-21细胞的生长曲线,结果表明两株病毒的增殖滴度相近,HA基因的替换未改变病毒的增殖特性。三、重组病毒对H9N2 AIV的免疫保护效果将感染有重组H9N1病毒株rPR8-HAm/H9的鸡胚尿囊液以0.1%的甲醛灭活,制备灭活疫苗,经疫苗的稳定性和安全性检验合格后,开展了其在鸡体上对H9N2AIV地方分离株JM0305株的免疫保护效果。同时设置了JM0305灭活疫苗组作为阳性对照组。结果表明,rPR8-HAm/H9免疫组的鸡在加强免疫2周后HI抗体水平达到6log2,血清中和抗体效价为1:22;其血清抗体对JM0305也有中和效果;JM0305灭活疫苗在加强免疫2周后HI抗体达到6log2,血清中和抗体效价为1:16。交叉中和试验结果表明,rPR8-HAm/H9免疫组的血清对JM0305有一定的中和效果。以JM0305株进行攻毒保护试验,结果表明,rPR8-HAm/H9免疫组对JM0305株的攻毒保护达到了80%,JM0305灭活疫苗组对JM0305的攻毒保护率为90%。排毒实验结果表明,rPR8-HAm/H9免疫组可较好的抑制JM0305株的排毒,在攻毒后的第五天不能检测到病毒,其结果优于JM0305灭活疫苗对照组。综上所述,本研究设计合成了H9N2亚型禽流感的HA马赛克序列;以H1N1流感病毒为骨架,通过HA基因替换,获得了表达HAm/H9蛋白的重组H9N1重组病毒株;以重组病毒制备灭活疫苗,发现其对H9N2禽流感病毒JM0305株具有较好的免疫保护效果,下一步将采用其他分支的H9地方分离株进行交叉保护测定。为后续H9亚型禽流感通用疫苗的研究提供了新的思路和方法,为广谱疫苗的研究提供了参考。