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光学纯手性醇及其衍生物是许多手性药物和手性功能材料的重要中间体,如何使用条件温和、绿色高效的生物催化法合成光学纯手性醇化合物一直被国内外研究学者所关注。对映体纯的4-甲氧基-1-苯基乙醇(MOPE)是很多药物合成的重要中间体,其(R)-型光学异构体可用来合成芳基丙酸类消炎止痛药物。目前,有关生物催化合成MOPE制备对映体纯产物的研究仍然有限,而且产物转化率相对较低,利用对映选择性氧化还原酶催化不对称还原制备手性芳香醇仍然存在着反应中必需辅酶再生困难和反应效率低等关键问题。本研究前期从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCCM 203011中挖掘出一种具有催化不对称还原反应活性的羰基还原酶SCRII,运用选择性区域氨基酸突变技术,通过改造该羰基还原酶获得其突变体SCRII-A220D,提高了其对4-甲氧基-1-苯基乙酮(MOAP)的催化活性,但其催化效率仍然有限。本研究针对生物催化不对称还原MOAP的反应特点,从催化体系和反应条件方面强化其合成效率,通过将羰基还原酶突变体SCRII-A220D的编码基因与葡萄糖脱氢酶基因gdh共表达,构建双酶耦联的重组菌,并在获得了高催化效率的共表达重组菌株后,对其全细胞和游离酶体系催化MOAP的反应进行了系统研究。具体内容如下:(1)为实现辅酶的再生,以适应大规模工业生产,将突变基因scr II-A220D与来源于Bacillus sp.YX-1的葡萄糖脱氢酶基因gdh连接构建共表达重组菌,在经17°C条件下添加终浓度为0.1 mmol?L-1的IPTG诱导表达培养14 h,筛选获得可高效催化不对称还原MOAP活性的共表达菌株E.coli BL21/p ET-SCRII-A220D-SD-AS-gdh,分析了其生物催化功能。(2)从双酶耦联共表达重组大肠杆菌全细胞催化体系的条件与过程调控出发,使用E.coli BL21/p ET-SCRII-A220D-SD-AS-gdh全细胞催化不对称还原MOAP,通过考察反应体系和环境条件对催化反应的影响,发现底物浓度、细胞质量浓度、反应体系温度和p H值等条件对最终产物效率的影响规律。优化最终条件为,在偏碱性的缓冲体系中,利用125 g?L-1重组细胞对10 g?L-1底物MOAP催化转化30 h,最终可得到光学活性产物(R)-MOPE,产物的光学纯度达到98%e.e.,产率达到82%。(3)从双酶耦联组合催化的游离酶体系和条件控制出发,使用该重组菌粗酶体系进行催化不对称还原MOAP,优化了反应条件和反应体系。发现辅酶浓度以及辅助底物对催化反应影响较大。在利用150 g?L-1重组菌粗酶,添加0.05 m mol?L-1辅酶NADP+驱动耦联辅酶再生反应,同时添加20 g?L-1葡萄糖作为辅助底物,对20 g?L-1底物MOAP催化转化12 h,最终可得到光学活性产物(R)-MOPE,产物的光学纯度达到98%e.e.,产率达到80%以上,研究结果为进一步生物催化合成芳基手性醇提供了应用研究的基础。