背景和目的创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是临床神经脑外科最常见的急、危、重症状之一。TBI在暴力性死亡中占首要位置。其程度从轻度脑震荡、轻度TBI到重度TBI不等。TBI占全身外伤发生率的第二位、死亡率的第一位,已成为45岁以下人群最重要的致残因素。在所有疾病当中,TBI具有最广泛、最多变的症状和结果。目前临床上尚缺乏慢性神经病理和神经行为以及TBI关联的早期神经病理学的相关治疗方案。目前TBI后经常出现严重的炎症及炎症反应,为了改善TBI结果,深入了解其机制。目前很多基础和临床研究者正在深入研究相关的动物模型以及临床个体一期、二期临床试验。在司法鉴定机构中,TBI也是法医师常见鉴定内容之一。TBI的发生备受世界各国医学研究者的广泛关注,已成为世界性主要健康问题。中度脑损伤占颅脑损伤年发病率的22%,通常会使患者有持续性缺陷。轻度脑损伤在人群中发病率最高,占总伤害的75%,甚至有可能高于流行病学统计报告,因为年轻人、运功员和军人的报告数量严重不足。总的来说,受社会经济收入因素的影响,TBI仍然是年龄在45岁以下的成年人最常见的死亡原因,也是造成长期残疾的最大原因。随着人口老龄化,我们也看到老年人口的相对发病率上升。随着对普通人群及军队特殊人群TBI意识的提高,TBI不再是一个沉默的话题。TBI既是急性障碍,也是一些患者的慢性神经系统疾病。然而,这种认识也揭示了科学文献中的许多问题需要进一步澄清,因为它引出了很多问题。TBI是由原发的损伤、继发的损伤两种损伤形式共同作用的一种十分复杂的疾病。继发的损伤是在原发损伤后出现的一种加重机体损害的情况。许多促进凋亡的诱导因子激活信号传导级联反应,致使相关蛋白磷酸化,促进凋亡程序,导致细胞凋亡,进而使病情恶化,在一定程度上严重影响了病人治疗和预后。研究已证实,继发损伤具有一定的延迟性,这给临床治疗方面提供了一定缓冲的时间。TBI后造成的脑水肿、脑出血、炎症等各种应激反应离不开信号通路、特异性蛋白与炎性因子的参与。在脑神经医学领域中,ERK信号传导通路是中枢神经系统相关疾病发生发展过程中重要传导途径之一,在脑缺血和脑创伤等神经细胞的凋亡过程中起到重要作用。静息状态下,ERK位于胞浆,机体受到外界刺激后,ERK发生磷酸化,磷酸化的ERK是ERK的活性形式,参与调节细胞生长、细胞凋亡。ERK信号通路可能通过提高下游MMP-9、IL-6的表达进一步加重TBI后的继发症状。为了验证ERK、MMP-9、IL-6三者之间的相关性,我们通过本实验制备TBI动物模型,并利用该模型观察大鼠脑组织损伤后病理生理变化,检测ERK、MMP-9、IL-6在TBI后不同时间段的表达,阐明三者在TBI后发生病理生理过程中的作用,研究其表达的时序性规律,为颅脑损伤时间的推断提供理论依据。方法健康成年清洁级SD(Sprague Dawley,SD)成年大鼠80只,雌雄不限,体重290-350g,统一购自河南省实验动物中心[许可证号:SCXK(豫)2015-0004]。适应性喂养14天后,随机分为对照组(大鼠只数:10)和实验组(大鼠只数:70)。实验组参照Feeney自由落体打击装置制备大鼠脑损伤模型;对照组大鼠不做颅脑打击,其他处理同实验组。按照伤后1h、6h、12h、24h、48h、72h、7d这七个时间点顺序,将对照组10只大鼠随机均分为免疫组化组、荧光定量PCR组,分别检测ERK、MMP-9、IL-6阳性细胞表达率和ERK mRNA、MMP-9 mRNA、IL-6 mRNA的相对表达量。(1)免疫组化组:心脏灌流后用4%多聚甲醛进行固定,断头取脑,制作石蜡切片,然后进行常规HE染色。观察大鼠脑皮质及海马形态学改变,并用免疫组织化学技术检测ERK、MMP-9、IL-6阳性表达。(2)荧光定量PCR组:于建模后对应时间点断头处死大鼠,无菌条件操作,立即取出全脑,以损伤灶为中心剪取伤侧脑组织约50g,标记编号,放于冻存管,置于液氮罐保存。按照实验计划提取总RNA,反转录成cDNA,通过荧光定量PCR检测ERK mRNA、MMP-9 mRNA及IL-6 mRNA的相对表达量。结果1.大鼠TBI后相关行为学观察结果:实验中,1只大鼠因颅脑受打击后出血过多而死亡;其余大鼠在颅脑受打击瞬间打击部位立即出血,四肢出现不同程度的短暂抽搐。精神模糊,并且各种反射暂时消失等现象。观察脑组织标本发现,大鼠颅脑损伤处有硬脑膜下腔血肿现象。2.大鼠TBI后神经功能评分结果:参考Arrieta Cruz等、Ziporen等两组实验团队制定的评分量表,对相应组大鼠进行颅脑损伤后1h评估,结果P<0.05。3.大鼠脑组织皮质和海马HE常规染色结果:组织间隙变大,神经元胞体之间结构不清。4.大鼠TBI后,实验组p-ERK 1h增高,6h-12h持续升高,24h-48h高表达,48h下降,7d时,p-ERK表达仍高于对照组5.大鼠TBI后,实验组MMP-1h时增高,1h-24h呈现持续增加状态,24h-72h高表达,7d表达仍高于对照组。6.大鼠TBI后炎性因子IL-6迅速增加,1h-24h持续增加,24h左右达高峰,24h-7d呈下降状态。结论1.大鼠颅脑损伤后,ERK、MMP-9、IL-6在脑组织皮质中的表达呈现一定规律性,有助于进一步探索颅脑损伤的机制。2.大鼠颅脑损伤后不同时间,ERK、MMP-9、IL-6的表达量不同,有望成为颅脑损伤时间推断的理论依据之一。