研究背景肝纤维化是乙肝、非酒精性脂肪肝炎等慢性肝病进展过程中所伴随的细胞外基质过度沉积的现象,是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤和影响慢性肝病预后的重要环节。目前临床上针对肝纤维化的主要治疗措施是针对原发疾病去除致病因素,如抗病毒治疗或改变生活方式等。然而由于肝纤维化发病机制复杂,多种细胞参与疾病进展,当前尚无有效的抗肝纤维化化学药物或生物制剂因此发展更为有效的抗纤维化疗法迫在眉睫。肝脏是机体主要的解毒器官,肝脏主要由肝脏实质细胞、肝脏星形细胞（Hepatic stellate cells,HSC）、肝巨噬细胞（Kupffer cells,KC）和肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells,LSEC）组成,肝脏实质细胞和非实质细胞（LSEC、HSC和KC）相互作用,促进了肝纤维化的进展。肝脏实质细胞是肝脏内比例最多的细胞,其受到氧化应激等其他外界因素刺激后发生损伤,从而释放损伤相关分子刺激HSC活化和LSEC失窗孔化,是引发肝纤维化病理进程的起始损伤因素;HSC位于狄氏腔内侧,是肝脏中细胞外基质的主要来源;LSEC是组成肝脏狄氏腔的壁细胞,LSEC窗孔结构是介导肝窦中血液和狄氏腔中细胞营养物质和氧气交换的重要通道,LSEC在受到损伤因素刺激后发生失窗孔化和分泌炎性因子,进而引起血液中氧气、药物、营养物质等渗透转运效率降低,从而加重肝脏缺氧,加重肝脏实质细胞凋亡损伤,促进肝纤维化进展。HSC是肝纤维化中的主要细胞外基质来源,肝脏实质细胞凋亡损伤是刺激HSC活化和肝纤维化进展的重要因素。目前抑制HSC活化及肝脏实质细胞凋亡的策略是临床前研究的重要研发方向,但部分效果良好的药物因其药物溶解性差、系统毒性高或者单一靶点有效性有限等原因,制约了其应用。纳米药物是一种新型的药物形式,具有良好的肝靶向性和多样化的生物功能,可提高小分子药物的药效并降低毒副作用,具有良好的应用前景。LSEC失窗孔化,造成了血液与狄氏腔中物质交换的转运屏障,降低治疗性纳米药物的转运效率。综合以上背景,打破肝窦内皮细胞失窗孔化的屏障作用,提高纳米药物的转运效率,减少肝脏缺氧,并结合纳米药物的协同调控策略,有望达到更好的抗肝纤维化疗效。在本研究中,我们从LSEC失窗孔化所带来的问题:药物转运屏障和肝脏缺氧凋亡损伤出发,设计了两种联合治疗策略。本研究主要分为两个部分:（1）调控肝窦内皮细胞窗孔结构提高多肽纳米药物的靶向递送效率及增效肝纤维化治疗的研究,通过利奥西呱（Riociguat,Rio）改善肝窦窗孔结构,从而解决纳米药物穿肝窦内细胞渗透不足的问题;（2）肝窦窗孔调控改善缺氧及其联合抗凋亡药物用于肝纤维化的研究,通过维持肝窦窗孔结构,从而改善肝脏缺氧,联合包载Sel的β-半乳糖聚乙二醇胆红素纳米药物（Galactose-modified polyethylene glycol bilirubin nanoparticles encapsulating Selonsertib,Sel@GBRNPs）清除ROS,有效抑制肝脏细胞凋亡。该研究为LSEC在肝纤维化中的屏障作用提供新的认识,为肝窦内皮相关靶点研究提供理论支撑。第一部分调控肝窦内皮细胞窗孔结构提高多肽纳米药物的靶向递送及增效肝纤维化治疗的研究研究目的本部分研究旨在研究慢性肝病进展过程中肝窦孔隙率及渗透性的变化,以期增进对肝窦窗孔转运渗透屏障的认识;进一步研究Rio对纳米药物穿越肝窦内皮细胞渗透效率的影响,并基于此探究打破肝窦转运屏障和改善肝纤维化治疗的新策略。实验方法1.肝纤维化发展过程中肝窦孔隙率及渗透性变化情况收集临床不同肝纤维化程度的肝脏标本,对肝脏标本进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）、天狼猩红和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）免疫组化染色实验,并进行扫描电镜制样观察肝窦窗孔结构情况。同时建立小鼠四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4）肝纤维化模型,分别在造模第0周、4周、6周和8周取小鼠肝脏组织,观察小鼠肝脏组织的肝窦孔隙率。此外对上述纤维化小鼠进行门静脉灌流100 nm尺寸荧光小球,灌流完成后制备肝脏组织切片观察荧光小球在肝脏内的滞留情况,以观察肝窦渗透性。2.Rio对肝窦孔隙率和渗透性的影响采用梯度密度离心法分离LSEC和HSC,建立体外共培养体系,并加入Rio（10μM）。培养72 h后,对LSEC进行扫描电镜制样,观察LSEC的表面孔隙情况。另准备LSEC,测定细胞内环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,c GMP）含量。建立CCl4诱导的肝纤维化模型,并分别在造模第4周、5周和6周,进行磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline,PBS）或者Rio干预治疗2周,结束后进行扫描电镜制样或者门静脉灌流荧光小球,观察Rio对肝窦孔隙率和渗透性的影响。3.多肽纳米药物表征采用固相合成法,分别合成靶向HSC的多肽IG和对照多肽AB。在超声条件下,对多肽和小分子药物JQ1的二甲基亚枫（Dimethyl sulfoxide,DMSO）储存液逐滴加入PBS溶液中,经过离心去除未包载的JQ1后,得到分散在PBS中的载带JQ1的HSC靶向多肽纳米颗粒（Insulin growth factor 2 receptor-binding peptide nanoparticles encapsulating JQ1,IGNP-JQ1）和载带JQ1的对照非靶向白蛋白多肽纳米药物（Albumin truncation peptide nanoparticles encapsulating JQ1,ABNP-JQ1）。采用透射电子显微镜、激光纳米粒度散射（Dynamic Light Scattering,DLS）表征纳米药物的尺寸和电荷,并采用HPLC测定纳米药物的包封率和载药率。体外培养HSC,采用流式细胞仪和激光共聚焦验证IGNP-Cy5.5和ABNP-Cy5.5的靶向性;另外分别在HSC和Hep G2细胞中,验证细胞对纳米载体的摄取情况。通过western blot实验和免疫荧光实验,验证IGNP-JQ1对HSC细胞活化能力的影响。为验证纳米体系在体内的分布情况以及Rio干预治疗对纳米体系体内分布的影响,我们建立了CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型,并采用小动物活体成像、肝脏组织切片和流式细胞术,分析IGNP-Cy5.5和ABNP-Cy5.5的体内分布情况。4.抗肝纤维化疗效建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型,对肝纤维化小鼠进行分组后,分别给予PBS、Rio+JQ1、IGNP-JQ1、Rio+ABNP-JQ1、Rio+IGNP-JQ1,经过2周治疗后,收集小鼠肝脏和血液样本,进行HE和天狼猩红切片染色,western blot实验和血清肝功能检测,评估肝纤维化进展程度。实验结果1.肝纤维化与肝窦孔隙率、渗透性的关系在临床收集的肝纤维化样本和小鼠肝纤维化模型肝脏中,肝纤维化在发展过程中,肝窦孔隙率逐渐降低:正常小鼠肝窦孔隙率为13.20%,小鼠经CCl4造模8周后肝窦孔隙率3.59%;通过肝窦灌流荧光小球,结果显示伴随肝窦孔隙率的降低,肝脏对于荧光小球的滞留减少,小鼠经CCl4灌胃4周和8周后,肝脏切片的荧光强度分别降低为正常小鼠24%和15%,提示肝窦内皮对荧光小球的渗透性降低。2.Rio对肝窦内皮孔隙率和渗透性的影响体外实验和小鼠CCl4模型实验结果表明Rio有助于维持肝窦孔隙率。体外培养LSEC结果显示,在Rio处理下LSEC孔隙率由PBS组的0.24%上升至4.18%,细胞内c GMP由PBS组的132.86 fmol/mg蛋白上升至344.66 fmol/mg蛋白,提示Rio升高LSEC胞内c GMP水平,并有助于维持LSEC窗孔孔隙率。在6周、7周和8周小鼠肝纤维化小鼠中,Rio均有助于维持肝窦窗孔结构（孔隙率6周Rio组9.83%,6周PBS组4.87%）,并增加了肝窦对荧光小球的渗透性。3.多肽表征多肽IG的临界胶束浓度（Critical micelle concentration,CMC）为2.167μM,基于多肽自组装合成的ABNP-JQ1和IGNP-JQ1尺寸均一,粒径约为100 nm左右;在多肽与JQ1质量比为1:1时,多肽IG和AB对JQ1的包封效率约为70%,采用此比例用于后续实验。通过流式和共聚焦实验,结果提示FITC标记的HSC靶向多肽纳米颗粒（Insulin growth factor 2 receptor-binding peptide nanoparticles labeled with FITC,IGNP-FITC）可靶向HSC细胞。Western blot实验提示,INGP-JQ1抑制了HSC细胞增殖,并降低了细胞周期蛋白4（Cyclin-dependent kinase 4,CDK4）、Collagen I和α-SMA表达,表明IGNP-JQ1抑制HSC细胞增殖并降低HSC细胞活力。体内分布实验表明,IGNP-Cy5.5在小鼠肝脏内分布较ABNP-Cy5.5更强（1.72倍）,且Rio治疗增加了HSC细胞中IGNP-Cy5.5的分布,提示Rio增加了IGNP-Cy5.5对HSC的靶向递送效率。4.Rio和IGNP-JQ1联用的抗肝纤维化效果通过CCl4灌胃6周,小鼠肝脏硬度为19.33 k Pa,IGNP-JQ1治疗组肝脏硬度为17.06 k Pa,经过Rio联用IGNP-JQ1治疗后,肝脏硬度降低至15.47 k Pa;天狼猩红阳性染色区域面积由PBS组的5.2%降低至1.5%,采用Rio治疗增加了靶向纳米药物抗肝纤维化的疗效。结论慢性肝病和肝纤维化发展过程中,肝窦孔隙率和渗透性逐渐降低。在联合治疗策略中,Rio能够维持相对正常的肝窦窗孔结构,从而打破肝窦内皮对纳米粒子的转运屏障,增加肝窦窗孔对纳米药物的渗透性,提高纳米药物IGNP-JQ1对HSC的靶向递送效率。为以肝窦失窗孔为特征的慢性肝病的治疗,提供新的思路。第二部分肝窦窗孔调控改善缺氧及其联合抗凋亡药物用于肝纤维化治疗的研究研究目的本部分研究旨在考察CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中,肝脏缺氧情况及Rio对肝脏缺氧情况的影响。合成具有清除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和抗肝脏细胞凋亡双功能的纳米药物Sel@GBNPs,并探究Rio调控肝脏缺氧状态联合Sel@GBRNPs对肝脏细胞凋亡和纤维化进展的影响。实验方法1.肝脏缺氧状态评估采用CCl4灌胃4周建立小鼠肝纤维化模型,模型建立成功后,分别经腹腔注射PBS或Rio（1mg/kg,每天给药）,给药2周后取小鼠肝脏进行聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）和western blot实验评估缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α）表达情况,凋亡蛋白Caspase 3表达情况以及吲哚箐绿（Indocyanine green,ICG）血浆清除情况;通过流式细胞仪评估肝脏炎性单核细胞浸润情况。2.Sel@GBRNPs合成与表征通过EDC/NHS反应合成β-半乳糖修饰的聚乙二醇-胆红素（Galactose modified PEG-Bilirulin,Gal-PEG-BR）,通过薄膜水化法合成包载Selonsertib的纳米药物Sel@GBRNPs,并采用HPLC评估Sel的包封效率。为验证GBRNPs对肝脏实质细胞的靶向性,体外采用流式细胞术和激光共聚焦验证了AML12细胞对Cy5.5@GBRNPs摄取情况,体内建立小鼠肝纤维化模型,评估Cy5.5@GBRNPs对小鼠肝脏实质细胞的靶向性。3.Sel@GBRNPs对AML12氧化应激模型细胞凋亡的影响通过H2O2诱导AML12氧化应激损伤模型,采用透射电镜、扫描电镜、流式细胞仪和CCK-8实验评估Sel@GBRNPs的凋亡保护作用。通过western blot实验,验证Sel@GBRNPs对AML12细胞凋亡信号调节蛋白（Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）通路活化的影响。4.抗肝纤维化疗效建立小鼠CCl4灌胃4周诱导的肝纤维化模型,模型建立成功后给予小鼠PBS、Rio+Sel、Rio+GBRNPs、Sel@GBNPs、Rio+Sel@GBNPs,给药完成后取小鼠肝脏进行切片HE、天狼猩红染色、α-SMA和磷酸化ASK1（p-ASK1）免疫组化染色,评估肝纤维化进展和p-ASK1磷酸化情况,通过TUNEL染色评估肝脏凋亡情况,同时采用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清炎性因子水平。实验结果1.Rio改善肝脏缺氧情况实验结果表明,肝纤维化小鼠肝脏HIF-1αm RNA水平较橄榄油对照小鼠升高2.69倍,HIF-1α蛋白水平较正常小鼠升高2.39倍,提示肝纤维化小鼠中存在缺氧情况。经过Rio治疗后,肝脏HIF-1αm RNA降低为PBS组的52%,蛋白水平降低为PBS组的0.762倍。流式细胞仪结果显示,经过Rio治疗后,肝脏内炎性单核细胞浸润由PBS组的9.9%降低为2.2%,同时肝脏内炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平均有所降低。上述结果提示,Rio改善了肝脏缺氧情况,部分缓解了肝脏细胞凋亡和肝脏炎性状态,为减少肝脏细胞凋亡奠定了病生理基础。2.Sel@GBRNPs的表征透射电镜结果显示,Sel@GBRNPs为均一的纳米颗粒,尺寸约为100 nm;流式细胞术和激光共聚焦结果显示,AML12细胞对Cy5.5@GBRNPs较游离Cy5.5具有更强的摄取。在活体成像中,Cy5.5@GBRNPs较游离Cy5.5在肝脏实质细胞内分布更多,提示半乳糖修饰增加了纳米颗粒对肝脏实质细胞的靶向性。3.Sel@GBRNPs对AML12细胞的凋亡保护作用通过CCK8实验,在H2O2浓度为400μM时,AML12细胞活力为60%,此H2O2浓度下Sel@GBNRPs预处理下AML12细胞活力提高至90%左右,提示Sel@GBRNPs对H2O2诱导损伤的保护作用。通过细胞形貌和细胞凋亡评估,Sel@GBNRPs减少AML12细胞皱缩和凋亡小体形成、释放,AML12细胞的凋亡比例由32%降低至18%,Sel@GBRNPs显著抑制AML12细胞ASK1磷酸化,并降低了细胞内ROS水平。细胞相互作用实验结果表明,经Sel@GBRNPs预处理的AML12细胞条件培养基对LSEC炎性和HSC细胞活化的刺激降低。上述实验结果提示,Sel@GBRNPs保护了AML12在过氧化氢诱导下的凋亡,同时减少了凋亡细胞对LSEC和HSC的刺激。4.肝脏缺氧改善和联合抗凋亡策略减缓肝纤维化进展在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中,肝脏胶原阳性面积为4.5%,经Sel@GBRNPs治疗后天狼猩红面积降低至2.0%,经过Rio+Sel@GBRNPs联合治疗后天狼猩红阳性面积区域进一步减少至1.1%;同样,模型组α-SMA阳性区域面积为7.7%,p-ASK1阳性区域面积为1.1%,经Sel@GBRNPs治疗后α-SMA阳性区域面积降低至5.7%,p-ASK1降低至0.8%,经过Rio+Sel@GBRNPs联合治疗后α-SMA和p-ASK1分别降低至4.0%和0.5%。TUNEL染色结果显示,经过Rio+Sel@GBRNPs联合治疗的凋亡细胞比例最低。肝纤维化模型小鼠血清TNF-α和IL-6的水平分别为168.5和44.71 pg/ml。上述实验结果提示,经过Rio预先调控肝脏缺氧状态,联合Sel@GBRNPs清除ROS和抑制ASK1活化,减少了肝脏细胞凋亡比例,并减缓了肝纤维化进展。结论在小鼠肝纤维化模型中,Rio改善了肝脏缺氧情况,为减少肝脏细胞凋亡创造了有利的药物递送和病理生理条件。利用Rio改善缺氧联合具有抗凋亡和清除ROS功能的纳米药物Sel@GBRNPs,减少了肝脏细胞的凋亡并减缓了肝纤维化进展,为肝纤维化治疗提供新联合策略。