论文部分内容阅读
PARP-1是一种参与翻译后修饰的DNA修复蛋白，是癌症治疗中的新靶点，寻找和开发高效的PARP抑制剂具有广阔的治疗前景。建立高效稳定的PARP活性测定方法、寻找合适的体内外抗癌研究细胞模型是发现新型PARP抑制剂的重要方法和手段。本文首先采用剩余底物定量法建立PARP-1的体外活性测定方法：确定底物NAD+浓度为12.5nmol·L-1，激活剂DNA浓度为15μg·mL-1。并以6.25×10-4U PARP-1建立PARP抑制剂的反应体系，得到Z’因子、S/B和CV值均满足高通量筛选模型，测得已知PARP抑制剂AZD2281的IC50为13nmol·L-1±2nmol·L-1。最终从82个化合物中筛选出52个对PARP-1的抑制率达50%以上，得到IC50小于0.5μmol·L-1的化合物11个。其次，以Hela细胞为模型建立细胞水平的PARPs活性评价方法：用DNA损伤试剂MNNG激活细胞内PARPs，15min时以ATP含量的变化为指标，建立间接的PARPs活性测定方法；5min时以PAR的变化为指标，建立直接的PARPs活性检测方法。并分别以AZD2281进行验证，基于此模型从17个化合物中筛选得到8个化合物的EC50为3μmol·L-1-9μmol·L-1，化合物25号和47号对细胞PARPs的抑制作用呈浓度依赖关系。最后，利用PARP抑制剂敏感型细胞进行化合物体内外的抗肿瘤功能性评价：验证了JF-305细胞对AZD2281的敏感性并发现AZD2281通过诱导DSBs损伤、引起细胞周期阻滞于S、G2/M期而导致JF-305细胞的凋亡；细胞活力检测及克隆形成实验发现47号化合物对MDA-MB-436及JF-305表现出细胞毒性作用，对JF-305的肿瘤生长有一定的抑制作用。本课题建立了体外PARP-1的活性测定方法和细胞水平PARPs的活性测定方法，选用一株对PARP抑制剂敏感的细胞应用于体内外的肿瘤抑制实验，建立了一套灵活稳定的寻找和发现具有抗肿瘤活性的PARP抑制剂的方法。