论文部分内容阅读
目的:对粘红酵母菌Rhodotorulaglutinis SWJS-JM1色素及胞外多糖成分进行提取,检测两类活性物质抗氧化和免疫调节活性及可能的作用机制。方法:(1)提取粘红酵母菌R.glutinis SWJS-JM1色素和细胞外分泌多糖,并对两类物质进行含量测定。(2)MTT方法检测两类物质对细胞生长情况的影响,并用H202刺激RAW264.7细胞制造氧化损伤模型。(3)应用流式细胞仪和荧光显微镜检测粘红酵母色素对RAW264.7氧化损伤细胞模型内ROS的影响。(4)Western blot法检测粘红酵母的色素提取物对RAW264.7氧化损伤细胞模型内HO-1蛋白表达水平的影响。(5)应用Real-Time PCR法检测粘红酵母菌R.glutinis SWJS-JM1的色素提取物对RAW264.7氧化损伤细胞模型内Nrf-2及其下游相关抗氧化酶HO-1、SOD1和SOD2的基因表达情况以及胞外多糖提取物对RAW264.7细胞内一氧化氮合酶(iNOS)以及TNF-α等细胞因子基因表达的影响。(6)格里斯试剂法(Griess法)检测粘红酵母的多糖提取物对RAW264.7细胞分泌NO的影响。结果:(1)经HPLC检测法对色素提取物进行分析,粘红酵母色素提取物β-胡萝卜素的平均含量为8.62%;苯酚-硫酸法测得粘红酵母胞外多糖提取物中多糖的平均含量为11.36%。(2)MTT结果显示,给药浓度在25μg/mL～400μg/mL之间的多糖提取物和浓度为20μg/mL～80μg/mL之间的色素对RAW264.7细胞物无明显毒害作用,浓度在25μg/mL～400μg/mL之间的多糖提取物孵育RAW264.7细胞48h后,细胞表现出显著性的增殖现象;H202刺激RAW264.7细胞30min,IC50值为1171μmol/L。(3)流式细胞仪的检测结果以及荧光显微镜下观察的结果显示:色素提取物可以显著降低H202刺激的RAW264.7细胞内的ROS水平。(4)Real-Time PCR法检测结果显示,色素提取物孵育后可以显著上调H202处理的RAW264.7细胞内血红素加氧酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)基因表达水平,但是对Nrf2基因的表达具有下调作用。同时,western blot法检测细胞内HO-1蛋白表达结果与Real-Time PCR检测结果一致。(5)Griess法检测结果显示:粘红酵母胞外多糖处理后,RAW264.7细胞分泌NO量显著增加,与一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的检测结果一致,并且IL-1β、IL-6、和TNF-α在胞外多糖孵育24h后均有不同程度的上调。结论:粘红酵母R.glutinis SWJS-JM1色素提取物主要成分为类胡萝卜素,β-胡萝卜素的平均含量为8.62%,中低浓度的色素提取物对RAW264.7细胞无明显毒害作用,并且可以显著降低用H202刺激的RAW264.7细胞产生ROS的水平,上调抗氧化酶HO-1、SOD1和SOD2基因的表达水平,具有较好的抗氧化活性;粘红酵母R.glutinis SWJS-JM1胞外多糖提取物中多糖的平均含量为11.36%,可以促进RAW264.7细胞的增殖和NO的分泌,上调iNOS、IL-1β、IL-6、和TNF-α基因的表达,发挥免疫调节的作用。总之粘红酵母R.glutinis SWJS-JM1色素具有抗氧化的作用,多糖提取物可通过调节炎症因子的表达发挥免疫调节作用,本实验的研究结果可为粘红酵母色素和胞外多糖作为保健品及药物新资源开发的提供理论依据,为粘红酵母菌R.glutinis SWJS-JM1的开发和应用奠定理论基础。