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背景MicroRNA是新近发现的一类存在于真核生物中的内源性单链小分子非编码RNA,长度约为17～22个核苷酸,具有高度的保守性、细胞组织特异性、时序性及位相性特征。此类RNA可通过参与基因转录后水平的调控,从而影响靶基因的表达,迄今为止,已发现数百种miRNA与人类密切相关,其中多种miRNA在调控心血管疾病的进程中不可或缺,正引起国内外学者的极大关注。MiRNA-143作为脂肪组织表达丰度较高的miRNA之一,在脂肪细胞的分化过程、脂肪代谢以及调控血脂水平中扮演着重要角色。脂肪细胞经氧化低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein, ox-LDL)刺激后是否影响细胞中miRNA-143的表达变化特点以及两者是否具有相关性,目前尚未见有研究报道。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一个体内众多细胞和系统参与的复杂病理生理进程,严重危害全球人类健康。动脉粥样硬化的使动环节即血清中存在过高水平的低密度脂蛋白胆固醇,它经氧化修饰被巨噬细胞吞噬,穿过内皮细胞进入血管内膜,进入内皮细胞下并沉积于血管壁,单核源性巨噬细胞吞噬胆固醇、血管内膜的内皮细胞损伤易感、血管壁平滑肌细胞增殖以及脂肪细胞坏死过度分泌,一系列细胞因子、粘附分子和炎症因子同样参与了整个过程,从而最终导致动脉粥样硬化斑块形成和冠心病的发生。脂联素是一种炎症相关性因子,在血管壁的炎症应答中起重要的调节作用,是胰岛素抵抗、糖尿病和动脉粥样硬化性疾病的保护性因子,脂联素是脂肪细胞分泌的最重要的脂肪因子,低脂联素血症与冠心病发病独立相关。关于miRNA-143对脂肪细胞脂联素表达和分泌的影响尚少见报道。目前,对游离脂肪酸代谢和细胞内胆固醇稳态的生化分子机制,对脂肪因子与miRNA相关性的研究,尤其是miRNA调控脂肪细胞脂联素表达的确切分子机制并不透彻。体内所有细胞都合成胆固醇,从乙酰辅酶A到最终合成胆固醇这一步骤有至少超过20种生物酶参与其中。血液循环中有低密度脂蛋白或极低密度脂蛋白,细胞亦可通过从血液循环中这些富含apoB载脂蛋白的脂蛋白中获取胆固醇,细胞间胆固醇的流动受到多种基因转录水平和转录后水平这样的反馈机制精确调节。胆固醇逆转运涵盖了单核巨噬细胞、肝细胞和脂肪细胞等参与,包括胆固醇的从巨噬细胞流出、被酯化、再次摄取和经粪便排泄等环节,它是体内的一个生理过程,令动脉粥样硬化斑块内,循环中和外周组织中过多的胆固醇排出体外,维持体内胆固醇的动态平衡。因此,促进胆固醇逆转运已成为延缓动脉粥样硬化的发展,甚至逆转动脉粥样斑块的策略之一。核激素受体超家族中的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor γ)在脂肪细胞中高表达,是LXRα(liver X receptor α)的上游基因,可增加LXRα基因的表达从而促进细胞内胆固醇流出。LXR是配体活化的转录核因子,直接调控着腺苷三磷酸结合盒转运体A1P(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)的表达。PPARy-LXRa通路在脂质代谢和胆固醇转运的平衡调控以及脂肪细胞胆固醇流出中具有重要作用。胆固醇逆转运的任一环节受到调控均可影响最终胆固醇逆转运效率。新近的国内外研究结果揭示,miRNA这一新型调控子在体内外实验中被证实确实能够调节内环境胆固醇稳态,但对于1niRNA-143是否能够调节脂肪细胞胆固醇流出的作用及其机制研究知之甚少。目的观察不同时间、浓度ox-LDL刺激对3T3-L1脂肪细胞中miRNA-143表达的影响,同时观察细胞转染miRNA-143模拟物和抑制物对脂肪细胞分泌脂联素及对其胆固醇流出的影响,并探讨可能的作用机制。方法3T3-Ll前体脂肪细胞促分化成熟后,分组后给予不同浓度的ox-LDL (0,50,100mg/ml)和不同时间(6,12,24小时)干预,后收集细胞提取总RNA,用ABI公司TaqMan试剂盒检测miRNA-143并计算2-△△CT值,采用Real-time PCR方法观察不同分组脂肪细胞的miRNA-143表达情况。将促分化成熟的脂肪细胞分为6组,经过优化转染实验,确定最合适的转染浓度,后分为miRNA-143模拟物组,miRNA-143抑制物组,FAM标记的miRNA-143模拟物的阴性对照组,FAM标记的miRNA-143抑制物的阴性对照组,以及Mock组。miRNA-143过表达试验：将促分化成熟的脂肪细胞分为3组,分别转染不同浓度的miRNA-143模拟物,使最终转染浓度分别为0nM,50nM,100nM。miRNA-143抑制试验：将促分化成熟的脂肪细胞分为3组,分别转染不同浓度的miRNA-143抑制物,使最终转染浓度分别为0nM,50nM,100nM。细胞转染均采用脂质体转染法。收集不同分组及业组的转染miRNA-143模拟物或抑制物组的脂肪细胞,提取总RNA和核蛋白或胞浆蛋白,用RT-PCR方法检测脂肪细胞中目的基因的mRNA表达,用Western blot方法检测目的基因蛋白水平,同样分组观察各组的胆固醇流出率,探讨脂肪细胞分泌功能和胆固醇流出率与miRNA-143的关系及可能机制。结果促分化成熟的脂肪细胞表达miRNA-143。经ox-LDL刺激后,与对照组相比,脂肪细胞的miRNA-143相对表达量下降(0.61±0.12,0.40±0.09),有统计学意义(p<0.01)：并且,不同浓度ox-LDL组(10ug/ml,20ug/ml)之间有显著差异,miRNA-143表达随ox-LDL干预浓度的升高而表达降低(p<0.05)。经20ug/ml的ox-LDL干预不同时间段,与对照组(0小时)相比,干预6h、12h、24h的脂肪细胞,检测其miRNA-143相对表达量逐步下降(0.87±0.10,0.63±0.12,0.392±0.06),较对照组差异有统计学意义(p<0.05)；并且,不同时间ox-LDL干预组(6h、12h、24h)之间有显著差异(p<0.01),miRNA-143表达随ox-LDL干预时间的增长而表达降低。建立成熟脂肪细胞转染miRNA-143模型,检测发现脂肪细胞高表达miRNA-143。miRNA-143模拟物转染可以增加脂肪细胞脂联素以及PPAR-γ mRNA的分泌,与对照Mock组(100.0±2.47)相比,其mRNA水平分别升高至145.5±7.20,175.1±2.25；而miRNA-143抑制物组的脂联素和PPAR-γ mRNA水平分别降低为46.3±0.80,40.5±0.62。转染miRNA-143模拟物同样增加脂肪细胞脂联素以及PPAR-γ蛋白的分泌,与对照Mock组(100.0±2.98)相比,其蛋白比值升高至196.3±3.14,230.0±3.23；而与对照Mock组相比,转染miRNA-143抑制物组的脂联素和PPAR-y蛋白水平降低为32.44±0.82,29.1±1.25；组间相比差距均有显著统计学意义(p<0.01)。MiRNA-143模拟物呈浓度依赖性增加脂联素与PPAR-y mRNA和蛋白的表达。与阴性对照组比较,50nM、100nM miRNA-143模拟物分别使脂联素mRNA表达升高至175.6±4.06、220.2±5.96；PPAR-γ mRNA表达升高至143.3±2.55、187.8±15.03。脂联素蛋白表达升高至139.1±3.34、154.3±3.34。PPAR-γ蛋白表达升高至127.9±4.30、133.2±5.20。组间差距有显著统计学意义(p<0.01)。MiRNA-143抑制物呈浓度依赖性降低脂联素和PPAR-γ的mRNA和蛋白表达。与阴性对照组比较,50nM、100nMmiRNA-143抑制物分别使脂联素mRNA表达下降至70.8±2.09,43.1±2.45；PPAR-γ mRNA表达下降至91.8±18.1,31±1.6。脂联素蛋白表达下降至65.6±3.91、30.0-0.65；PPAR-γ蛋白表达下降至70.5±2.50、15.5±0.68。组间差距有显著统计学意义(p<0.01)。以apoAI为胆固醇流出的接受体,转染miRNA-143模拟物增加了脂肪细胞胆固醇流出的效率(24.9±6.04%),而转染miRNA-143抑制物能显著降低脂肪细胞胆固醇流出的效率(9.7±3.21%),组间对比差异具有统计学意义(p<0.05),而转染miRNA-143模拟物阴性对照组、抑制物阴性对照组与Mock组相比组间差异无统计学意义(p>0.05)。转染miRNA-143影响脂肪细胞PPARγ, LXR-α, ABCA1mRNA表达水平,模拟物增加其三者表达175.1±2.25,175.8±11.58,188.6±5.16,而抑制物降低其表达水平40.5±0.62,35.8±2.20,40.5±0.42。且组间差异有统计学意义(p<0.05)。瞬时转染miRNA-143模拟物能够增加脂肪细胞PPARγ, LXR-α, ABCA1蛋白表达水平分别至230.0±3.23,228.9±6.63,199.6±3.85,转染miRNA-143抑制物能够降低PPARγ, LXR-α, ABCA1蛋白表达水平分别至29.1±1.25,32.7±1.77,37.0±0.70,与Mock组对比,组间差异均有统计学意义(p<0.05)。结论1.促分化成熟的3T3-L1脂肪细胞表达miRNA-143.2. Ox-LDL呈剂量依赖性和时间依赖性的下调脂肪细胞miRNA-143的表达。3. MiRNA-143转染影响脂肪细胞脂联素的分泌。4.脂肪细胞转染miRNA-143模拟物可剂量依赖性的增高PPARγ mRNA及蛋白表达水平,而miRNA-143抑制物的转染则呈剂量依赖性的降低前两者的mRNA及蛋白表达水平。5. MiRNA-143对脂肪细胞分泌脂联素的调节可能经由PPARγ途径实现。6. MiRNA-143影响脂肪细胞胆固醇流出的效率。7. MiRNA-143模拟物能显著提高脂肪细胞中PPARγ, LXR-α, ABCA1的mRNA及蛋白表达水平,而miRNA-143抑制物可显著降低脂肪细胞中三者的mRNA及蛋白水平。8. MiRNA-143通过PPARγ-LXR-α信号通路,影响了脂肪细胞中胆固醇转运体ABCA1的表达水平,进而影响了脂肪细胞胆固醇流出的效率。