论文部分内容阅读
目的胃癌是一种发病率、死亡率很高的恶性肿瘤,其发生发展是一个多步骤的过程,涉及许多基因的改变。虽然进行了大量研究,但其分子机制仍不清楚。S100A4是肿瘤侵袭转移相关的重要基因,它促进肿瘤细胞运动、蛋白水解、细胞与基质粘附、促使肿瘤细胞脱离母体肿瘤等,在肿瘤转移过程中发挥重要作用。研究发现S100A4在食管癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤组织中表达明显增高。本课题组前期研究并报道了S100A4基因与胃癌的关系,证实了S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关,LEE和Cho YG等也报道了类似的结果。但是S100A4在胃癌中高表达的机制尚不清楚。大多数实体瘤具有低氧的微环境,在肿瘤发生发展过程中一个关键的步骤是肿瘤细胞对低氧的适应。低氧微环境可通过调控多种基因表达而促进恶性肿瘤发生浸润转移,其中转录调节因子HIF-1（hypoxia inducible factorl）在这一过程中发挥重要作用。当实体肿瘤处于低氧环境时,HIF-1活性显著增高,参与调节一些与肿瘤发生发展相关的基因表达,从而影响肿瘤细胞的生物学特性,介导机体的整体和局部低氧适应反应,促进肿瘤的进展。本课题组前期研究结果表明低氧处理可使胃癌细胞中S100A4基因高表达,因此本课题拟深入研究低氧调控S100A4基因表达的机制。首先应用生物信息学方法在S100A4基因的第一内含子中预测到一个低氧反应元件（hypoxia responsive element,HRE）,然后对胃癌细胞BGC823进行低氧处理,用EMSA及ChIP等方法鉴定HIF-1与HRE的结合,并分析HRE及其附近序列的碱基变化情况,以阐明低氧对胃癌细胞中S100A4基因表达调控的机制。对上述问题的研究将对揭示胃癌发生发展的分子机制具有重要指导意义。材料与方法1、实验材料:胃癌细胞系BGC823（来源于低分化腺癌）;细胞培养相关试剂;电泳泳动迁移实验（EMSA）、染色质免疫沉淀（ChIP）相关试剂;Western印迹杂交以及PCR相关试剂等。2、实验方法:细胞常规培养,并用CoCl2处理;Western印迹杂交检测HIF-1蛋白的表达;生物信息学方法预测S100A4基因中的HRE;EMSA方法鉴定HIF-1与S100A4基因中HRE的体外结合;ChIP实验进—步在体内条件下验证HIF-1与该位点的结合:PCR-测序分析胃癌标本中S100A4基因内HRE及其附近序列的变化情况。结果1、Western Blot结果显示低氧诱导试剂CoCl2处理BGC823细胞6小时后HIF-1蛋白表达开始升高,高水平表达持续到48小时。2、EMSA和ChIP方法结果显示S100A4基因+329～+334区域是HIF-1结合位点。3、通过PCR产物测序和BLAST分析,在25例胃癌标本中未发现S100A4基因中的HRE及邻近序列（+44～+550）存在变异。结论1、初步认识低氧诱导试剂CoCl2处理后,BGC823细胞中HIF-1蛋白表达水平的动态变化特点。2、用EMSA和ChIP方法初步证实S100A4基因第一内含子中含HRE（+329～+334）。3、在25例胃癌标本中未发现S100A4基因中HRE及邻近序列存在变异。