猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)是一种新的圆环病毒,可引起猪的皮炎和肾病综合征、繁殖障碍及多系统炎症等,最初于2016年在美国被发现,随后在韩国、巴西、意大利、波兰等国家陆续报道。近两年来,PCV3已在我国多个省市被发现且感染范围越来越广泛,对养猪业构成的潜在威胁已不容忽视。然而,针对PCV3的研究尚处于起步阶段,要了解该病毒在猪群中的感染与传播情况,及时监测和分析是首要的步骤。因此,建立准确而快速的检测方法将有助于有效控制PCV3的传播,特别是将该方法用于临床病例的监测及种猪贸易检验检疫。本研究通过PCV3巢式PCR检测方法的建立和应用,旨在为监测安徽地区猪群中PCV3的感染情况,进而为深入开展PCV3的流行病学等研究提供技术支撑。1、PCV3巢式PCR检测方法的建立本研究根据GenBank中登录的PCV3全基因序列(登录号:MF084994)设计内、外2对巢式PCR特异性引物,并通过以下试验建立PCV3巢式PCR检测方法:(1)设置 54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃和 60℃7 组不同的退火温度进行退火温度的筛选以及通过对第一轮PCR扩增产物按100倍、50倍、10倍3个稀释倍数进行稀释作为第二轮PCR模板进行PCR反应条件的优化试验。(2)利用建立的该方法对PCV3与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)5种常见病毒的检测进行特异性试验。(3)利用建立的该方法与普通PCR方法同时对(10-10～10-1)不同稀释度标准质粒的检测进行灵敏性试验。(4)通过对10-8、10-9、10-10拷贝/uL浓度标准质粒的批间和批内检测对建立的该方法进行重复性试验。(5)利用建立的该方法与商品化PCV3实时荧光PCR检测试剂盒同步检测临床收集的血清样品,使用Kappa分析比较两种方法的检测结果进行符合率验证。结果显示:(1)58℃为本研究建立的PCV3巢式PCR的最佳退火温度,当一扩产物作50倍稀释进行二扩获得的扩增结果最好。(2)除PCV3扩增出预期的目的条带外,PCV2、CSFV、PRV、PRRSV、PEDV 5种病毒均无目的条带出现。(3)该方法的最低检测限为1.74×10拷贝/μL,较普通PCR的灵敏度高105倍。(4)10-8和10-9拷贝/uL的标准品模板平行样品均有目的条带的出现,但模板浓度为10-10拷贝/uL时,3份平行样品均无目的条带;10-8、10-9拷贝/uL的标准品模板3次试验均出现目的条带,但模板浓度为10-10拷贝/uL时3次均无目的条带。(5)本研究建立的巢式PCR方法与商品化PCV3实时荧光PCR检测试剂盒同步检测78份血清样品,PCV3的阳性率分别为30.77%和33.33%,两种方法检测结果的Kappa分析系数为0.94,一致性较好。2、PCV3巢式PCR检测方法的应用应用本研究建立的PCV3巢式PCR检测方法对源自安徽15个地市528份不同临床样品进行PCV3的检测。并通过SPSS 22.0软件对不同样品来源、不同临床症状、不同生长阶段以及不同类型样品中PCV3的阳性率进行数据处理,采用卡方检验进行数据分析。结果显示:安徽15个地市528份临床样品中PCV3总阳性检出率为20.45%,其中12个地市均存在PCV3的感染现象。在临床表现为呼吸道疾病、繁殖障碍、神经症状、腹泻、高热、急性死亡、消瘦的猪群中均检出PCV3,阳性检出率在5.00%～44.44%之间,无显著性差异;不同生长阶段的猪(哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪、死胎)均存在PCV3感染,阳性检出率分别为14.52%、19.35%、25.42%、29.69%、24.24%,差异不显著;PCV3在病料组织混样、血清及粪便中的检出率分别为18.72%、33.33%、12.50%,其中血清样品的阳性检出率显著高于组织混样;PCV3在猪的脑、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结中的检出率分别为21.21%、23.33%、26.67%、20.18%、31.25%、47.83%,其中PCV3在淋巴结中的检出率显著高于脾脏。综上结果表明:(1)本研究建立的PCV3巢式PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品的检测。(2)安徽大部分地区均存在PCV3感染;PCV3与猪呼吸道疾病、繁殖障碍、神经症状、腹泻、高热、急性死亡等疾病的发生存在一定的关联;各生长阶段的猪均可感染PCV3;血清样品中PCV3的阳性检出率高于组织混样;PCV3可分布于不同的组织器官中,淋巴结的阳性检出率最高。