“去血供疗法”是临床上针对不可切除肝癌常用的治疗手段,主要包括肝动脉结扎(Hepatic artery ligation, HAL),经肝动脉栓塞(Transarterial embolization, TAE)和经肝动脉化疗栓塞(Transarterial chemoembolization, TACE)等。其中TACE是目前中晚期肝癌的标准治疗手段。另外,近年成为终末期肝癌标准疗法的抗血管生成治疗(如Sorafinib和Sunitinib等)在一定程度上也属于“药物性去血供”的范畴。值得注意的是,虽然“去血供治疗”疗效被多数临床随机对照研究或荟萃分析证实,但其也存在以下不确定性：①治疗不彻底,残留少数肿瘤细胞,成为日后肝癌复发、转移的来源。②疗效短暂,仅能延缓而不是阻断肝癌发展,病人中位生存期最多延长至16个月。③少临床观察发现治疗本身促进残癌细胞的侵袭、转移,甚至导致病人生存期缩短。④多中心临床随机对照分析提示术前TAE／TACE不能延长可切除肝癌病人的生存期,可能与“去血供”后肿瘤肺转移增加有关[9]。基于上述发现,本实验拟研究“去血供治疗”对残余肝癌侵袭、转移潜能的影响,分析其分子机制及可干预靶点,为进一步提高“去血供”疗效提供理论依据。由于获取“去血供治疗”后临床肝癌样本较为困难,开展“去血供”后残余肝癌生物学特性的研究多通过动物实验来完成,主要选用动物源性肿瘤,不具有人源性背景；且一般采用经血管直接注入癌细胞的“实验性转移模式(Experimental metastatis)”,不能完整反映肝癌侵袭、转移的全过程。本实验用较高转移潜能的人肝癌细胞(MHCC97)及较低转移潜能的HepG2或Hep3B细胞行裸鼠原位种植,继以HAL模拟临床“去血供”,为开展相关研究提供了合适的体内实验平台。该动物模型特征如下：人肝癌裸鼠原位种植成瘤率几近100%(56／56)；较高转移潜能的MHCC97(或带红色荧光标记的MHCC97-R)移植瘤自发肺转移率达40%以上[17]；而低转移潜能的HepG2(或带红色荧光标记的HepG2-R)或Hep3B(或带红色荧光标记的Hep3B-R)移植瘤腹腔转移率也超过50%。通过分析肝脏移植瘤生长曲线、瘤内血供(彩色多普勒超声)及侧枝循环建立时间,选定原位接种肝癌术后2周为HAL手术时机。HAL手术成功率达到93.3%(28／30)HAL后,移植瘤内缺氧细胞(Pimonidazole阳性染色)及组织缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-induced factor-1α, HIF-1α)蛋白水平显著增加(P<0.05),证实“去血供”有效。考虑到“去血供治疗”主要的生物学效应是诱发或加重瘤内缺氧,为进一步分析缺氧对肿瘤细胞生物学特性的影响,本研究用氯化钴(CoCl2)诱导肝癌细胞缺氧建立了体外模型。通过分析其量效性,选定100μmol/L作为CoCl2诱导肝癌细胞缺氧的有效浓度；同时对比其时效性,发现处理肝癌细胞12h后,细胞内HIF-1α蛋白表达即增加,48h-72h达到高峰。因此以48h-72h作为体外实验的有效时间段。利用上述HAL模型,本研究观察“去血供治疗”对肝癌原发瘤生长和残癌细胞侵袭、转移潜能的影响。结果发现,(1)HAL后肿瘤组织坏死增加,残癌细胞增殖抑制,原发瘤体积缩小——MHCC97-R移植瘤体积：HAL组2.0±0.2 cm3 vs.假手术组4.0±0.6cm3(P<0.01)；HepG2-R移植瘤体积：HAL组2.8±0.2 cm3 vs.假手术组4.6±0.9mm3(P<0.05)。(2)但残癌细胞的局部侵袭和远处转移明显增加,表现为：①肝脏原发瘤组织学显示,HAL导致肿瘤包膜破坏、残癌细胞局部侵袭,微血管侵犯和癌栓形成。②体视荧光显微镜显示,HAL增加肝癌移植瘤肝内、外转移(MHCC97-R:肝内播散+腹膜种植+肺转移；HepG2-R:肝内播散+腹膜种植)。③荷瘤裸鼠肺组织连续切片发现,MHCC97-R肝癌细胞肺转移率和转移灶数量也在HAL后显著增加(HAL组83.3%[10／12]与66.1±15.6个／只vs.假手术组33.3%[4／12]与49.3±6.8个／只,P<0.05)。(3)生存分析发现,HAL不能延长动物生存时间——MHCC97-R:HAL组56.0±4.6天vs.假手术组60.7±5.8天(P>0.05)：HepG2-R:HAL组54.3±4.5天vs.假手术组60.7±5.8天(P>0.05)。类似结果也见于体外实验,进一步证实“去血供”促癌效应与缺氧的相关性：100μmol/L CoCl2诱导缺氧显著抑制肝癌细胞增殖,但提高了细胞运动和侵袭潜能：(1)缺氧培养48h后,肝癌细胞迁移距离较常氧组增加：MHCC97细胞：缺氧组472.5±87.2μm vs.常氧组346.8±65.6μm(P=0.022)；HepG2细胞：缺氧组474.9±65.4μm vs.常氧组388.3±67.7μm(P=0.041)。(2)缺氧培养72h后,肝癌细胞侵袭数目也较常氧组增加(个／200x视野)：MHCC97:缺氧组75.8±12.7 vs.常氧组43.3±4.9(P=0.003)；HepG2:缺氧组52.0±4.6 vs.常氧组26.7±5.5(P<0.0001)。结果证实,“去血供治疗”虽然抑制肝癌原发瘤生长,但促进了残癌细胞的侵袭、转移,与缺氧的生物学效应有关。缺氧是“去血供治疗”的主要抗癌机制,但也有上述促癌效应。近年来缺氧增加肿瘤细胞侵袭、转移潜能及诱导放、化疗抵抗等均被广泛证实,并以促进肿瘤血管新生最为重要。然而瘤内缺氧具有波动性,新生肿瘤血管及侧枝循环反过来缓解缺氧,也减弱了其促癌效应。本研究对HAL后肝脏移植瘤缺氧的实效性及与血管生成的相关性做分析。结果发现,HAL短期(2天)内增加肿瘤组织HIF-1α蛋白表达及缺氧细胞数量(P<0.05),但对远期(4周)无明显影响(P>0.05)。术后2天,HAL组血清VEGF水平(922.5±59.3 pg／mL vs.349.6±46.5 pg／mL,P<0.01)或移植瘤组织VEGF表达较假手术组升高(P<0.05),而4周时上述指标无显著差异(P>0.05)。HAL组移植瘤内微血管密度(Microvessel density,MVD)在术后2天较对照组有增加趋势,但与4周时类似,两组差异均不具有统计学意义(P>0.05)结果证实,HAL增加肝癌组织短期而并非远期的缺氧,可能与缺氧促进肿瘤血管新生及侧枝循环形成,重塑肿瘤血供有关。新生肿瘤血管形成是一个持久过程,上述短暂缺氧更可能激活某些早期促转移机制(如粘附性降低)提高残癌侵袭、转移潜能。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤转移的起始环节,被视为癌细胞入血前的特征性改变。发生EMT的肿瘤细胞获得间质表型,具有更强的侵袭能力,从而利于其脱离原发病灶,侵入周围血管或淋巴管系统,形成远处转移。缺氧促进肿瘤细胞发生EMT,增加侵袭潜能的证据已有报道,本实验研究“去血供”与EMT的关联性是基于：(1)上述实验结果(中华实验外科杂志,2009,26：988-990)——“去血供”通过诱导肿瘤早期而并非长期缺氧,最终增加残癌转移,提示短暂缺氧可能激活某些转移早期机制如EMT,促进转移。(2)文献报道TAE/TACE能引起肝癌组织间质化,出现肉瘤样变,其分子特征符合EMT变化,如上皮分子E-cadherin表达减少和间质分子Vimentin上调等。结果显示,(1)在100μmol/L CoCl2诱导的体外缺氧环境中,PLC/PRF/5、HepG2、Hep3B和MHCC97 4种肝癌细胞均出现类似EMT的形态学变化——由紧密联结、铺路石样的生长模式向分散、纺锤样多极化的形态转化。EMT相关分子表达也发生改变：①上皮分子E-cadherin下调和间质分子N-cadherin、Vimentin表达增加；②EMT相关转录因子Snail、Slug和Twist表达增加。并且上述改变与缺氧肝癌细胞增强的运动和侵袭能力有关。(2)在体内模型上,HAL不但导致肿瘤组织E-cadherin表达减少,而且促其细胞内移位；同时N-cadherin、Snail、Slug和Twist等EMT相关分子上调。该变化与HAL后残余肝癌增加的局部侵袭和远处转移相关。另外,HAL加重瘤内缺氧的同时还诱导癌旁组织缺氧,癌旁正常肝细胞上类似的EMT分子变化也被观察到,并通过正常肝细胞L02的体外缺氧实验得到证实。结果证实,“去血供治疗”及其诱导的缺氧通过激活肝癌细胞EMT而促进转移。众所周知,肿瘤细胞过度增殖是肝癌最重要的恶性表型。但我们研究发现,肝动脉断流抑制残癌细胞增殖(Cancer Science,2010,101：120-128),似乎与“去血供”后增强的肿瘤侵袭、转移潜能相矛盾。因为Wnt/β-catenin通路是调控肝癌细胞增殖的关键信号,β-catenin为其核心分子,本实验拟研究β-catenin在缺氧环境中的表达与功能的变化。另外,我们前期工作显示,肝癌细胞内β-catenin下游靶分子c-Myc和cyclinD1在缺氧环境中表达减少；而Slug, Twist以及肝癌干细胞标记分子EpCAM等上调(Cancer Science,2010,101：120-128；中华普通外科杂志,2009,24：790-793),提示β-catenin在缺氧促癌机制中的复杂性。结果显示,(1)β-Catenin异常表达：缺氧不改变肝癌细胞β-catenin mRNA水平,但影响其蛋白表达和／或细胞内定位：缺氧PLC/PRF/5和HepG2细胞内β-catenin蛋白总量增加(＞2.3倍),而缺氧MHCC97及Hep3B细胞则出现明显的β-catenin胞内积聚(＞1.7倍)。上述β-catenin的稳定表达与缺氧下调肝癌细胞内GSK-3β,抑制β-catenin蛋白降解有关。(2)β-Catenin功能转化：缺氧环境中异常表达的β-catenin不上调主管增殖的c-Myc和cyclinD1基因,而增加侵袭相关的靶分子Slug及Twist表达,诱导缺氧相关EMT的发生。敲除β-catenin显著抑制缺氧促癌效应并逆转缺氧细胞EMT。提示β-catenin促进缺氧恶性潜能并发生功能转化——从促增殖向促侵袭转化。(3)β-catenin与HIF-1α的相关性：免疫共沉淀技术发现缺氧肝癌细胞内β-catenin与HIF-1α形成分子复合物,但β-catenin的异常表达与HIF-1α无关。而敲除β-catenin却能减少HIF-1α蛋白表达,提示缺氧细胞内HIF-1α增加受p-catenin调控。在临床肝癌样本上,β-catenin与HIF-1α显著相关(P=0.034 &Pearson’sχ2 test, P= 0.013),共表达β-catenin和HIF-1α的肝癌病人更易出现术后转移,具有较短的总生存时间和肿瘤复发时间。结果证实,缺氧诱导肝癌β-catenin激活及功能转化,调控细胞EMT,促进肿瘤侵袭、转移。根据EMT发生和β-catenin活化与缺氧恶性表型的相关性,本实验分别将EMT和β-catenin作为干预靶点,协同“去血供”治疗裸鼠肝癌。结果显示：(1)将PI3K特异性抑制剂LY294002作为阻断细胞EMT的药物[39],发现100μg/g LY294002虽然不能进一步缩小HAL治疗后的移植瘤体积,但显著减少了肿瘤转移(P<0.05),并延长荷瘤裸鼠生存时间(70.7±5.5天vs.59.2±5.9天,P=0.006)。机制分析显示LY294002逆转缺氧诱导的肝癌细胞EMT相关分子表达,并通过阻止GSK-3β降解而抑制β-catenin表达。(2)选定干扰素α(interferon-α, IFN-α)为细胞内β-catenin的有效抑制剂,发现IFN-α不但减少肝癌β-catenin表达,还有效逆转缺氧细胞内上皮分子E-cahderin的下调及间质分子N-cadherin增加。体内实验显示IFN-α剂量依赖性地增加HAL疗效：中等剂量(7.5×106U/kg)的IFN-α即显著抑制HAL增加的肿瘤肺转移(20%[1/5]vs.100%[5/5],P=0.048),延长荷瘤动物生存时间(68.7±5.5天57.2±3.7天,P=0.001)。结果证实,LY294002和IFN-α均能抑制β-catenin表达,阻断肝癌细胞EMT,增强HAL疗效。