结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率在发展中国家不断增加。目前肿瘤治疗药物主要通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长，大多数癌细胞由于细胞凋亡机制失调而具有耐药性。Necroptosis是一种Caspase非依赖性细胞死亡方式，主要通过RIPK1和RIPK3严格调控，并且由MLKL执行完成。细胞受到内源性和外源性因素影响时，可诱导细胞发生DNA损伤(DSBs)，而DNA的DSBs是最严重的一种损伤。细胞发生DSBs后会激活细胞周期检查点，协调修复DNA损伤，调节基因表达。DSBs损伤分子标记物γH2AX在Necroptosis过程中会招募线粒体中的AIF易位形成DNA降解复合物，DNA DSBs的产生对染色质的溶解具有重要作用。Necroptosis为癌症治疗提供了新策略。
　　本实验室已从黍糠中提取出一种含血红素辅基的阳离子过氧化物酶(pro so millet peroxidase，PmPOD)，并且发现PmPOD可以诱导HCT116和HT29细胞发生RIPK1和RIPK3依赖性Necroptosis。虽然其确切的分子机制仍不清楚，但最近研究发现PmPOD可通过体外水解机制切割DNA，具有磷酸酶活性，暗示PmPOD可能会对细胞内DNA造成损伤。
　　为了进一步分析PmPOD诱导HCT116和HT29细胞DNA损伤及其潜在作用机制。本课题以结直肠癌HCT116和HT29细胞为实验模型，以PmPOD为实验材料，对PmPOD诱导结直肠癌细胞Necroptosis诱因进行了深入研究。通过流式细胞术和ATP水平检测，结合特异性Necroptosis抑制剂Nec-1和凋亡抑制剂z-VAD-fmk，确定了PmPOD诱导结直肠癌细胞Necroptosis;免疫荧光染色证明PmPOD类似于HRP，结直肠癌细胞通过胞饮作用摄入PmPOD;通过细胞周期检测、彗星电泳实验、免疫荧光染色和Western Blot等方法检测了PmPOD作用结直肠癌细胞后，细胞DNA损伤情况;彗星电泳实验与坏死抑制剂、抗氧化剂结合，检测了PmPOD诱导DNA损伤与Necroptosis、细胞内ROS水平升高之间的关系;最后通过siRNAp53和p53异位表达，研究了PmPOD诱导DNA损伤和Necroptosis中p53的潜在作用机制。
　　结果发现，PmPOD以剂量和时间依赖性方式诱导HCT116和HT29细胞Necroptosis，用特异性Necroptosis抑制剂Nec-1预处理HCT116和HT29细胞可阻止PmPOD诱导的细胞增殖抑制作用，而凋亡抑制剂z-VAD-fmk处理HCT116和HT29细胞没有作用。在结直肠癌细胞中PmPOD通过胞饮作用进入细胞，并且PmPOD进入细胞是诱导DNA损伤和Necroptosis必须的。PmPOD进入HCT116和HT29细胞后导致细胞周期停滞于S期，同时PmPOD诱导细胞DNA损伤和DSBs，以及γH2AX表达水平以时间依赖性和剂量依赖性方式显著增加。当细胞p53基因敲低后会显著加剧PmPOD诱导的DNA损伤，p53异位表达显著地降低了PmPOD诱导的DNA损伤。这说明在结直肠癌细胞中，PmPOD依赖于p53的表达发挥其细胞毒性作用。这些结果都表明，在HCT116和HT29细胞中PmPOD诱导DSBs是Necroptosis的主要原因，肿瘤抑制蛋白p53可减轻PmPOD诱导Necroptosis通过p53介导的修复途径，促进细胞存活。