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目的:本研究探讨了不同浓度异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的影响及机制,旨在为异甘草素在治疗人脑胶质瘤的应用提供一定的实验依据。方法:(1)采用无血清培养基(含EGF、FGF、B27)以培养皿、培养瓶及Cyagen6孔悬浮细胞培养板为载体培养SHG44人脑胶质瘤干细胞,通过CD133、Nestin联合Bcl-2标记进行免疫荧光鉴定,并对比其倒置显微镜下细胞形态及干细胞球的形态、大小及数目,通过扫描电镜观察干细胞形态。(2)经对比研究后,采用Cyagen 6孔悬浮细胞培养板为载体提取、纯化和培养SHG44人脑胶质瘤干细胞,以无血清DMEM/F12培养基(含EGF、FGF、B27)(含与实验组等量的DMSO)为对照组,异甘草素(5~160μmol/L)为实验组,通过CCK-8法检测作用12 h、24 h、48 h及72 h后的细胞活性,并观察药物作用至第7 d胶质瘤干细胞球的形成情况。(3)通过浓度和时间筛选后,以无血清DMEM/F12培养基(含EGF、FGF、B27)(含与实验组等量的DMSO)为对照组,异甘草素(10~160μmol/L)为诱导组,DAPT(2.0μmol/L)为阻断剂组,异甘草素+阻断剂组(10~160μmol/L+2.0μmol/L DAPT),通过免疫荧光染色观察异甘草素作用24~72 h后细胞表面分化标志物神经胶质酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)及干细胞标志物巢蛋白(Nestin)表达情况,通过Western blot检测异甘草素作用72 h后Nestin、GFAP及β-TubulinⅢ的表达情况,通过流式细胞术检测异甘草素作用72 h后的细胞周期,通过Real-time PCR检测作用72 h后Notch1、RBP-JK及Hes1的表达。结果:(1)SHG44胶质瘤干细胞在无血清培养基中呈悬浮克隆球样生长,免疫荧光染色鉴定干细胞标记物CD133、Nestin表达呈阳性,且癌基因Bcl-2表达呈阳性;Cyagen 6孔悬浮培养板培养纯化的胶质瘤干细胞球较培养皿和培养瓶纯化的胶质瘤干细胞球大且数目多(P<0.05);对于Cyagen 6孔悬浮培养板,随着纯化次数增加,胶质瘤干细胞球更大、数目更多(P<0.05),且呈更规则球形;倒置显微镜下胶质瘤干细胞呈类圆形,扫描电镜下呈球形,可见较长梭形突起和较多细小突起,细胞间以触角沟通。(2)异甘草素在12-48h,随着浓度增加细胞增殖活性增强,且p<0.05,72h后随着浓度增加细胞增殖活性显著降低,且p<0.05;隔日加药至第7d时,经统计分析胶质瘤干细胞球数目减少、直径减小(与对照组比),且p<0.05,当异甘草素浓度小于40μmol/l时,与160μmol/l相比,干细胞数目、直径均具有统计学意义(p<0.05),当异甘草素浓度大于40μmol/l时,与160μmol/l相比,干细胞数目、直径均无统计学意义(p>0.05)。(3)对照组胶质瘤干细胞无明显分化,异甘草素组在24~48h,随浓度增加分化细胞越多,且干细胞随之减少,在72h后,随着浓度增加分化细胞及干细胞同时减少。westernblot实验结果显示:异甘草素作用72h后:与对照组比较,随着异甘草素浓度的增加nestin蛋白表达量逐渐下调,差异具有统计学意义(p<0.05);与对照组比较,10、40、160μmol/l组gfap蛋白表达水平均上调,差异具有统计学意义(p<0.05),且40μmol/l组gfap蛋白表达量较其他浓度组均较高,差异具有统计学意义(p<0.05);与对照组比较,10、40、160μmol/l组β-tubulinⅢ蛋白表达水平均上调,差异具有统计学意义(p<0.05),且10μmol/l组β-tubulinⅢ蛋白表达量较其他浓度组均较高,差异具有统计学意义(p<0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果:异甘草素作用72h后,与对照组相比,随着异甘草素浓度的增加g0/g1期细胞比例显著增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。real-timepcr检测结果:notch1通路阻断剂作用后,与对照组比较,各异甘草素组和阻断剂组notch1、rbp-jk及hes1基因表达均显著下调,差异具有统计学意义(p<0.05);与异甘草素组比较,notch1、rbp-jk及hes1基因表达在异甘草素加dapt组及阻断剂组显著下调,差异具有统计学意义(p<0.05);与阻断剂组比较,notch1、rbp-jk及hes1基因表达在异甘草素加dapt组显著下调,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:(1)cyagen6孔悬浮细胞培养板是培养胶质瘤干细胞较理想的载体。(2)异甘草素能诱导shg44人脑胶质瘤干细胞向星形胶质细胞和神经元细胞分化,且能抑制胶质瘤干细胞的增殖。(3)异甘草素诱导SHG44胶质瘤干细胞向星形细胞和神经元细胞的分化可能与下调Notch1信号通路中的Notch1、RBP-JK及Hes1有关。