本论文主要针对蛋白质C末端进行了系统的研究。基于生物质谱技术,发展了一整套蛋白质C末端的富集、鉴定及相对定量的新技术及新方法,用于高效、准确地揭示蛋白质C末端多方面的生命信息,包括准确的C末端序列测定以及C末端肽段的相对定量,由此对蛋白质C末端在生命活动过程中所起的重要生物意义以及蛋白质降解过程有更好的认识。蛋白质的C末端在蛋白进行各项生命活动过程中都起着极其重要的作用。它不仅标志着DNA转录翻译成蛋白质过程的初步完成,更是参与和调控了蛋白质的各种生理功能。但是目前通过组学手段大规模的鉴定蛋白质C末端的方法仍然局限于经典的质谱鉴定策略,并没有一套完善的富集与鉴定蛋白C末端的方法。对于数据库内不存在的蛋白质新C末端的鉴定,以目前的鉴定方法仍然很难实现。所以在蛋白质C末端越来越受到人们重视的同时,目前也亟需在方法学上有进一步的突破。本论文结合恶唑酮化学,使蛋白质C末端可以特异性地带有标签,在此基础上发展了一系列的衍生化试剂,用于蛋白质C末端的富集、定性及相对定量,并且能够对生命体中内源性降解产生的新C末端进行鉴定甚至是De novo测序。此外,对于“自下而上”技术路线中一个关键的步骤---酶解的效率不够高的难题,发展了物理吸附型的酶解反应器并从原理上探讨了其工作机理。所以本论文致力于建立高效、实用的C末端新的分析策略,解决当今蛋白质C末端组学上面临的技术难题。本论文工作的主要成果和突出贡献如下：第一章绪论简要概述了基于大分子生物质谱的蛋白质组学研究对象及其研究意义。对于目前广泛使用的各种定性和定量技术及其中存在的主要问题作了基本的介绍。特别着重对提高酶解环节效率的固定化酶解反应器进行了详尽的描述。论文详细阐述了蛋白质C末端的研究意义以及在研究中所面临的主要困难,并按照各种富集鉴定方法所采用的原理进行了分类并一一作了归纳和总结。最后,提出了本论文选题的目的和意义所在。第二章针对蛋白质C末端难以通过传统的生物质谱鉴定方法确认和鉴定,并且无法在质谱中识别内源性新产生的蛋白质C末端的难题,发展了一种基于恶唑酮化学的同位素标记策略,实现在复杂的生物样品中同时进行蛋白质C末端的鉴定和相对定量。该方法结合了恶唑酮化学法和轻重双标的精氨酸同位素标记。通过恶唑酮反应,精氨酸特异性地与蛋白的α-羧基结合。将蛋白酶解之后,带有同位素标签的C末端肽段在质谱中会以对峰的形式呈现,从而与其他的酶解肽段区分开来。通过进一步的串联质谱分析,得到C末端肽段的序列信息。使用精氨酸作为衍生化试剂,可以增强C末端肽段的碱性,大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外,轻重双标的同位素标记还可以实现蛋白C末端肽段的相对定量。当标有轻重同位素标记的样品混合后进行质谱分析,同位素峰的信号强度之比即代表了来源于不同样本之间C末端肽段的相对含量比例。通过标准肽段以及标准蛋白定量方法的检验,显示出该方法有着良好的动态线性范围。研究表明在2个数量级的范围内都保持一致的线性和很高的重现性。相关系数(R2)都在0.99以上,且变异常数(CV)控制在11%以内。随后该方法运用于腾冲嗜热菌的研究之中,用于考察在不同温度条件培养下的腾冲嗜热菌的蛋白C末端的表达水平的差异。共有68条C末端肽段被成功鉴定到,其中有53条在两个温度下的腾冲嗜热菌中都被鉴定到并有相对定量信息。在有表达差异的C末端肽段中,大部分都归属于各种酶蛋白,所以我们推想,温度确实是一个影响腾冲嗜热菌生物活性的重要因素。此外,该方法同样可以去寻找和验证生命体内的内源性新C末端(neo-C-termini).总共有24条非C末端肽段作为可能是内源性新产生的C末端肽段被成功鉴定。大部分都定位于完整蛋白的N末端或者C末端附近,说明了蛋白的N端和C端有着非常高的反应活性,在生命活动中也起着非常重要的作用。第三章作为第二章工作的延续和深入,针对C末端肽段在整个样品中的相对含量较低,并且蛋白质丰度动态范围过大,不利于质谱鉴定等问题,发展了与目前应用的反向富集相反的正向富集策略。在恶唑酮化学的基础上,使一端连有生物素(biotin),一端连有精氨酸的双功能化试剂与蛋白的C末端特异性的结合。标记的蛋白在酶解后,通过链霉亲和素(streptavidin)与生物素之间的亲和作用,将C末端肽段进行特异性的富集。这样的富集策略,可以大大减少样品的复杂程度,提高C末端的鉴定效率以及鉴定通量。首先在标准肽段和标准蛋白层面上,对恶唑酮反应条件以及链霉亲和素富集的条件进行了摸索和优化,标记反应的效率能够提高到90%以上,并且富集的特异性也得到了保证,在标记肽段和非标记肽段1：50混合的情况下,仍然能够达到很好的富集效果。衍生化试剂中由于含有精氨酸,可以增强C末端肽段的碱性,这大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外针对于标记肽段在二级谱图中一些特殊的碎裂结果,对蛋白数据库检索方式也进行了优化。标记上的精氨酸和生物素在二级质谱图中也会呈现出类似于b,y离子的子离子峰,但是在搜库中并没有加以利用,所以我们设置了生物素作为第21种氨基酸,并修改了蛋白的数据库,在蛋白C末端之后人为的加上了精氨酸和生物素的序列,以提高C末端肽段的质谱鉴定效率。随后我们将该方法应用于实际样品的C末端检测中,选取腾冲嗜热菌为模式生物,经过三次的技术重复后,总共有183条C末端肽段被成功的鉴定到,比先前鉴定得到的数据规模有了极大的提高。第四章针对传统的酶解过程中较低的酶解效率以及自降解现象导致整个技术流程的灵敏度和效率过低的问题,从固定化酶解反应器角度入手,系统而深入地讨论了物理吸附类型的酶解反应器的工作过程。我们同时考虑了静电相互作用和亲疏水性作用对物理吸附带来的不同效应。首先为此合成了一系列由不同高分子层包裹的纳米硅球,详细地评估了不同纳米硅球在催化酶解过程中发挥的效率问题。我们合成了外层分别包覆聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly diallyldimethylammonium chloride, PDDA)和聚苯乙烯磺酸(poly styrene sulfonate, PSS)的纳米硅球。这两种硅球表面聚合物的电荷性质不同,在酶解体系(25 mM碳酸氢铵,pH约为8)中分别带有正电荷及负电荷,而聚合物包裹又保证了纳米硅球的尺寸和形貌的一致性。此外还合成了表面连有疏水性有机长链的纳米硅球,该类硅球在酶解体系中保留了原硅球表面所带的负电荷,同时在水溶液体系中又具有疏水性的特点。不同材料分别用于标准蛋白细胞色素C和卵清白蛋白的酶解实验研究。这两种蛋白在酶解溶液体系中带有不同的电荷,但都属于疏水性蛋白。我们发现不同的材料对于具有不同等电点的蛋白有着明显差异的酶解效率。所以静电作用确实在吸附过程中是作为决定性的驱动力作用,在静电相互作用的存在下,亲疏水性作用只是一个次要因素。如果蛋白酶和待酶解的底物蛋白都带有与材料相反的电荷,那么在静电相互作用的影响下,它们能够同时被吸附在固相载体的表面,在材料周围局部范围内提高了蛋白酶以及蛋白的浓度,从而使得酶解过程在较短的时间内达到平衡,提高了酶解效率。另一方面,如果酶和底物两者带有异种电荷,那么它们始终不能同时被一种材料吸附,所以相比于传统的溶液酶解,此类的吸附酶解反应器的效率并不能有所提高。除了确定物理吸附型酶解反应器中起决定作用的吸附因素之外,对于吸附-酶解的动力学过程也尝试了基本的研究。我们发现不管是异种电荷相吸还是同种电荷相斥,基于静电相互作用的吸附平衡总是能够在很短的时间内达到,所以如果将酶解反应器看做是一个吸附-酶解的二级反应的话,蛋白的酶解过程是整个吸附酶解反应中的决速步骤。这对今后进一步的研究酶解动力学问题起着很好的指导作用,为发展下一代的吸附型酶解反应器建立了一定的理论基础和指导帮助。综上所述,本论文围绕蛋白C末端研究中鉴定和富集方面的热点、难点问题,以恶唑酮化学结合各种标记试剂为技术手段,以发展相关的蛋白质组学C末端研究新技术新方法并进行实际的应用研究为目标,建立了将化学衍生标记应用于质谱分析的策略,为解决蛋白质组学中C末端肽段的富集、识别、质谱鉴定以及相对定量提供了新颖有效的研究手段和方法。