非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)是一类在细胞中不翻译成蛋白质的RNA分子,通常没有明显的开放阅读框(open reading frame,ORF),非编码RNA广泛存在于人类基因组的转录组中,据估计约占细胞总转录本的90%以上。ncRNA可由专一的非编码RNA基因转录而来,也可源自蛋白质编码基因的反义链、内含子以及蛋白质编码基因间的序列。目前,ncRNA尚未有一个明确的分类标准,通常依据其转录本的长度人为地将超过200nt的称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),其余的则称为短链非编码RNA。非编码RNA曾被认为只是基因组转录活动的“噪音”,但近年来大量的研究表明,ncRNA在细胞中的表达具有明显的时空特异性,而对部分ncRNA生物学功能的研究进一步提示其在细胞的生命活动中扮演着极为重要的角色。在细胞中,ncRNA主要是以RNA的形式发挥其功能,它们通过碱基互补配对与其他核酸分子相互结合、模拟其他生物大分子的空间结构而竞争性地抑制其与相互作用分子的结合、通过空间阻遏作用而干扰靶基因的转录活动、募集染色质修饰相关的蛋白质而改变靶基因的表观遗传修饰等,从而在多种水平、不同层次上调节生命活动的正常进行。天然反义RNA,也称天然反义转录本(naturally antisense transcripts, NATs),是指在细胞中由编码正义RNA(通常为蛋白质编码基因)DNA链互补的DNA链(即反义DNA)编码的转录本。其中绝大部分为非编码RNA,但也有极少部分在细胞中可翻译成蛋白质。NATs最早在病毒和原核生物中被发现,随后的研究表明天然反义RNA的表达是真核生物基因组转录的一种普遍现象,在小鼠与人基因组中70%的转录单元(transcript unit)存在天然反义RNA,其中有约17%的NATs分子在小鼠与人类中是保守的。虽然高等真核细胞中大多数基因都存在天然反义RNA,但已被实验鉴定的仅占其中极小的一部分,我们目前所面临的最大挑战是通过实验来验证这些天然反义RNA的存在并揭示其生物学功能。NATs根据其来源的不同可以划分为顺式NATs (cis-NATs,在其转录位点的局部发挥生物学功能)和反式NATs (trans-NATs,可以在其转录位点以外的其他区域发挥功能)两类,其在细胞中通过转录阻滞、基因组重排、染色质重构、基因组印记、调控mRNA选择性拼接、mRNA的编辑和细胞内的定位、调控mRNA稳定性和翻译效率、屏蔽靶mRNA分子上的miRNA结合位点以及形成内源性siRNA等来调控靶基因的表达。已有的研究表明,绝大部分已被鉴定的NATs在细胞中抑制靶基因的表达,但也有少数可上调靶基因的表达。通过对已发表文献的检索及GenBank中表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)数据库的分析,我们发现Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)信号通路中重要的接头蛋白(adaptor protein)TIRAP/Mal (TIR domain-containing adaptor protein/MyD88 adaptor-like)的编码基因在小鼠与人中存在保守的天然反义RNA (TIRAP-AS)。在小鼠中,TIRAP基因定位于9号染色体,基因组序列全长16kb,由7个外显子组成。而我们通过生物信息学分析鉴定的TIRAP-AS基因由3个外显子组成,其中第1外显子与TIRAP基因的第6外显子的大部分序列反向互补(图2),其内含子的剪切位置符合GT-AG拼接规则,且存在典型的polyA加尾信号。此外,来源于TIRAP-AS的EST序列UI-M-BH1-ami-a-04-0-UI.s2(GenBank登记号)含有明确的polyA序列,提示TIRAP-AS是细胞中经过转录后加工的成熟RNA分子,并非基因组非特异性转录活动的产物。TIRAP蛋白在细胞中主要是参与MyD88依赖的信号转导途径,当特异性激活TLR2或TLR4时,TIRAP首先移位至细胞膜并通过其氨基端的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, PIP2)结构域与PIP2结合,然后再通过保守的TIR(Toll/interleukin 1 receptor domain-containing)结构域与MyD88蛋白结合并将其募集至TLR受体,继而激活下游的MAPK蛋白激酶与转录因子NF-κB,诱导促炎细胞因子如TNF-a与IL-1等的表达。可见,TIRAP在MyD88依赖的信号通路的激活中具有不可替代的作用。综上所述,作为参与TLR受体信号传导通路的重要分子,TIRAP蛋白在细胞中的功能改变将直接导致机体的先天性免疫反应异常。但目前对TIRAP基因的表达调控机制还知之甚少,其天然反义RNA分子(TIRAP-AS)是否在细胞内调控TIRAP基因的表达?其具体的调控机制及其生物学意义是什么?对这些问题的深入研究将有助于揭示TIRAP基因在细胞中的表达调控机制,促进我们对TIRAP在先天性免疫反应中功能的进一步认识。针对上述科学问题,我们以已知的TIRAP-AS EST序列为基础,通过cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE) PCR技术从来源于小鼠的单核巨噬细胞RAW264.7中克隆获得TIRAP-AS的全长cDNA序列。我们克隆的TIRAP-AS基因cDNA存在十种不同形式的拼接体,其长度在1000nt至1200nt之间,与TIRAP mRNA的重叠配对区(overlapping region)长度为447个核苷酸(nucleotide,nt).生物信息学分析显示这些TIRAP-AS分子缺乏明显的开放性阅读框,极有可能是非编码RNA分子。此外,TIRAP-AS基因内含子的剪切位置完全符合经典的GT-AG拼接(splicing)规则,存在典型的poly A加尾信号,而且我们克隆获得的TIRAP-AS cDNA序列3’末端含有polyA序列,表明TIRAP-AS在细胞中需要经过复杂的转录后加工。在获得TIRAP-AS RNA10种选择性拼接体序列的基础上,我们设计了可特异性区分它们的引物,以来源于RAW264.7细胞cDNA为模板,以含有TIRAP-AS选择性拼接体的质粒为阳性对照,进行PCR扩增,结果显示选择性拼接体1A、1B、1D与1E相对表达水平较高,是其在RAW264.7细胞中表达的主要形式。在此基础上,我们分别以含有TIRAP与TIRAP-AS cDNA的质粒为标准参照,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA分子在RAW264.7细胞中的相对表达水平,结果表明TIRAP mRNA的表达水平大约是TIRAP-AS RNA的8倍。此外,我们还采用了定量PCR分析了TIRAP mRNA与TIRAP-AS RNA在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、皮肤等8种不同的组织中的相对表达水平,以P-actin为内参照,结果显示TIRAP mRNA在不同组织中的表达水平由高到低依次为：肝>肌肉>心脏>肾>肺>脾>皮肤>脑,而TIRAP-AS RNA分子在不同组织中的表达水平则为：肝>肌肉>心脏>肺>脑>皮肤>肾>脾。同时,我们还采用Western蛋白印迹分析了TIRAP蛋白质在不同组织中的表达水平,若以心脏为对照组,则它在脑组织中的表达相对较高,在脾、肺、肌肉等组织中的表达相当,在肝和皮肤组织中的表达相对较低,在肾组织中几乎不表达。由于TIRAP蛋白主要参与TLR2与TLR4激活后的下游信号转导,我们首先采用100ng/ml LPS (TLR4特异性激动剂)和100ng/ml Pam2CSK4(TLR2特异性激动剂)刺激RAW264.7细胞和,于不同时间点(Omin、30min、60min、 120min、240min、480min)收集细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化,同时采用Western蛋白印迹技术检测TIRAP蛋白表达水平。结果显示：激活TLR2或TLR4受体可诱导RAW264.7细胞TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA水平均呈现出类似的时间依赖性改变；而且LPS刺激可诱导RAW264.7细胞中TIRAP蛋白呈现时间依赖性的下降。此外,采用100ng/ml LPS刺激C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMM)诱导TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化趋势与RAW264.7基本一致。为了进一步分析其他类型的TLR受体激活对TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA表达水平的影响,我们分别采用小鼠TLR1-9不同激动剂刺激RAW264.7细胞1h,回收细胞并采用实时荧光定量PCR分析TIRAP mRNA和TIRAP-ASRNA的表达水平的变化,结果显示100 ng/ml Pam3CSK4(TLR1/2特异性激动剂)与5μM ODN1826(TLR9特异性激动剂)同样可以诱导RAW264.7细胞中TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA水平的显著性下降(p<0.05)。以上结果提示TIRAP mRNA与TIRAP-AS RNA水平的动态变化可能参与了对细胞炎症反应的调控。在以上结果的基础上,我们分别采用200nM wortmannin(PI3K/Akt抑制剂)、200nM SP600125 (JNK1/2抑制剂)、200nM PD98059 (ERK1/2抑制剂)与10μM SB203580(p38抑制剂)等特异性的蛋白激酶抑制剂预处理RAW264.7细胞1h,然后再采用LPS刺激1h,定量PCR分析结果表明200nM wortmannin预处理可特异性地抑制LPS诱导的TIRAP-AS RNA水平的下降(p<0.05),但对TIRAP mRNA的表达水平无明显影响,而MAPK蛋白激酶抑制剂则对两者的表达水平均无明显的影响,表明LPS刺激是通过激活PI3K7Akt蛋白激酶诱导了TIRAP-ASRNA的下调。最后,为了探索LPS诱导的TIRAP-AS RNA表达水平下调的分子机制,我们首先采用100ng/ml LPS预处理RAW264.7细胞1h,然后再加入5μg/ml的放线菌素D(actinomycin D,ActD)抑制RNA的转录,于不同时间点(Omin、30min、 60min、90min、120min)回收细胞并采用定量PCR分析TIRAP mRNA与TIRAP-AS RNA表达水平的变化。结果显示LPS刺激可以降低RAW264.7细胞中TIRAP-AS RNA的稳定性,但对TIRAP mRNA的稳定性未有明显影响。而采用200nM wortwannin预处理1h则可以完全抑制LPS刺激诱导的TIRAP-AS RNA稳定性的下降,表明LPS刺激可通过激活PI3K/Akt激酶而诱导TIRAP-AS RNA稳定性的下降,从而导致其在细胞内的表达水平的下调。综上所述,本论文已取得的实验结果如下：1.通过RACE PCR技术成功克隆了在RAW264.7细胞中表达的十种TIRAP-AS选择性拼接体cDNA全长序列,其中拼接体TIRAP-AS 1A、1B、1D与1E是其最主要的表达形式;2.RAW264.7细胞中TIRAP mRNA表达水平约是TIRAP-AS RNA的8倍；3.TIRAP mRNA在C57BL/6小鼠不同组织中的表达水平由高到低依次为：肝>肌肉>心脏>肾>肺>脾>皮肤>脑,而TIRAP-AS RNA分子在不同组织中的表达水平则为：肝>肌肉>心脏>肺>脑>皮肤>肾>脾。若以心脏为对照组,则TIRAP蛋白质水平在脑组织中的表达相对较高,在脾、肺、肌肉等组织中的表达相当,在肝和皮肤组织中的表达相对较低,在肾组织中几乎不表达；4.特异性激活TLR2与TLR4均可诱导TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平呈现出类似的时间依赖性改变,TIRAP蛋白呈现时间依赖性的下降；5.LPS激活TLR4诱导TIRAP-AS RNA分子稳定性的下降,并下调其在细胞中的表达水平,可能是通过激活PI3K/Akt蛋白激酶诱导的。总之,我们通过研究鉴定了TIRAP基因的天然反义RNA分子,特异性的炎症刺激可通过激活TLR2与TLR4受体信号通路,激活其下游的PI3K/Akt蛋白激酶并诱导TIRAP-AS RNA稳定性的下降,从而导致其在细胞中表达水平的下调,但其具体的分子机制尚有待进一步的实验去揭示。