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目的：1.观察丙戊酸钠(Valproate acid sodium, VPA)对乳腺癌Hs578T细胞缝隙连接功能(gap junction, GJ)的影响及其对阿霉素(Adriamycin, ADM)体外抗肿瘤作用的影响。2.初步探讨丙戊酸钠改变GJ功能的可能机制。方法：1.VPA对Hs578T细胞GJ功能的影响1.1MTT法检测VPA对Hs578T细胞的细胞毒性。1.2细胞接种荧光示踪法检测VPA对Hs578T细胞GJ功能的影响。2.VPA对ADM细胞毒性的影响2.1MTT法检测ADM对Hs578T细胞的细胞毒性。2.2用不同密度接种细胞的方法,获得生长融合细胞(细胞之间有紧密接触,有条件形成GJ)与生长未融合细胞(细胞之间无接触,无条件形成GJ),在上述不同密度接种的细胞,采用MTT法观察5mM VPA对ADM的细胞毒性的影响。为了进一步验证在有GJ形成的条件下,VPA对ADM细胞毒性的影响,我们采用MTT法检测不同浓度的VPA (0、2.5、5、10mM)作用Hs578T细胞24h后,对ADM的细胞毒性的影响和5mM VPA作用Hs578T细胞不同时间(0、6、12、24h),对ADM的细胞毒性的影响。3.VPA对ADM诱导细胞凋亡作用的影响3.1用不同密度接种细胞的方法,获得生长融合细胞(细胞之间有紧密接触,有条件形成GJ)与生长未融合细胞(细胞之间无接触,无条件形成GJ),在上述不同密度接种的细胞,采用Annexin V/PI双染法观察5mM VPA对ADM诱导细胞早期凋亡作用的影响。实验观察5mM VPA预处理Hs578T细胞24h,再用1μM ADM处理Hs578T细胞8h,ADM诱导的细胞早期凋亡率的变化。3.2在有GJ形成的条件下采用Hochest33258荧光染色法检测5mM VPA处理Hs578T细胞24h,对ADM诱导细胞晚期凋亡作用的影响。4.VPA改变GJ功能的可能机制4.1Western Blotting检测不同浓度的VPA (0.1.25.2.5.5mM)处理Hs578T细胞24h,对细胞Cx43总蛋白表达的影响。此外,在此实验中进一步采用Western Blotting观察5mM VPA处理Hs578T细胞不同时间(0、6、12、24h)后,对细胞Cx43总蛋白表达的影响。4.2细胞免疫荧光法检测不同浓度的VPA (0.0.625.1.25.2.5.5mM)处理Hs578T细胞24h,对细胞表面Cx43蛋白表达的影响。此外,在此实验中进一步采用细胞免疫荧光法检测5mM VPA处理Hs578T细胞不同时间(0、6、12、24h)后,对细胞表面Cx43蛋白表达的影响。4.3Western Blotting检测不同浓度的VPA (0.0.625.1.25.2.5.5.10mM)处理Hs578T细胞24h,对细胞Src激酶表达的影响。此外,在此实验中进一步采用Western Blotting检测5mM VPA处理Hs578T细胞不同时间(0、6、12、24h)后,对细胞Src激酶表达的影响。4.4PP2对Hs578T细胞GJ功能的影响4.4.1MTT法检测PP2对Hs578T细胞的细胞毒性。4.4.2荧光接种示踪法检测不同浓度的PP2(0.1.2.4.8处理Hs578T细胞24h,对细胞GJ功能的影响。此外,在此实验中进一步采用荧光接种示踪法检测8μM PP2处理Hs578T不同时间(0、6、12、24h),对细胞GJ功能的影响。4.4.3Western Blotting检测不同浓度的PP2(0、1、2、4、8μM)处理Hs578T细胞24h,对细胞Src激酶表达的影响。此外,在此实验中进一步采用Western Blotting检测8μM PP2处理Hs578T不同时间(0、6、12、24h),对细胞Src激酶表达的影响。4.4.4Western Blotting检测不同浓度的PP2(0、1、2、4、8μM)处理Hs578T细胞24h,对细胞Cx43蛋白表达的影响。结果：1.VPA增强Hs578T细胞GJ功能MTT检测结果显示VPA在0～10mmol/L的浓度范围内并不影响细胞存活率。细胞接种荧光示踪结果显示VPA(1.25～5mmol/L)处理Hs578T细胞24h,可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递(P<0.01)。与对照组相比,VPA处理后细胞的荧光传递功能分别增加了40.12%、110.23%、140.13%和160.34%;5mmol/L丙戊酸钠处理Hs578T细胞不同时间(6h、12h和24h)可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递(P<0.01)。与对照组相比,VPA预处理不同时间后细胞的荧光传递功能分别增加了70.06%、110.26%和160.31%。结果表明,在Hs578T细胞中VPA可以显著增强GJ功能。推测,在Hs578T细胞中VPA可以增强ADM的体外抗肿瘤作用。2.VPA增强ADM的细胞毒性MTT检测结果显示ADM (0.5、1、2、4、8μmol/L)作用Hs578T细胞24h,细胞存活率分别为91.12%、79.15%、70.01%、50.07%和46.23%。MTT法检测结果显示在高密度接种(有GJ形成)条件下,用5mM VPA增强GJ功能后,8处理Hs578T细胞24h,细胞存活率显著低于8单用组(P<0.01)；而在低密度接种(无GJ形成)条件下,用5mM VPA预处理组的细胞存活率与8μM ADM单用组相比无显著差别(P>0.05)。同时MTT检测结果显示在细胞融合的条件下,VPA (2.5、5、10mM)预处理Hs578T细胞24h,1μMADM作用细胞24h后的细胞存活率都显著高于ADM单用组(P<0.01)。并且MTT检测结果显示在细胞融合的条件,随着5mM VPA预处理时间的延长,可以显著增强ADM的细胞毒性。结果表明,在Hs578T细胞中VPA可以通过增强GJ功能而显著增强ADM的细胞毒性。3.VPA增强ADM诱导的细胞凋亡Annexin V/PI双染结果显示在高密度接种(有GJ形成)条件下,用5mMVPA增强GJ功能后,1μM ADM处理Hs578T细胞8h,细胞早期凋亡率显著高于1μM ADM单用组(P<0.01)；而在低密度接种(无GJ形成)条件下,用5mMVPA预处理组诱导的细胞早期凋亡率与1μM ADM单用组相比无显著差别(P>0.05)。Hochest33258荧光染色结果显示在有GJ形成的Hs578T细胞中,用5mMVPA增强GJ功能后,1μM ADM作用Hs578T细胞24h,细胞晚期凋亡率显著高于1μM ADM单用组(P<0.01)；单用VPA组对细胞凋亡无影响。结果表明,在Hs578T细胞中VPA可以通过增强GJ功能而显著增强ADM诱导的细胞凋亡作用。4.VPA改变GJ功能的可能机制Western blotting结果显示VPA (1.25～5mmol/L)处理Hs578T细胞24h,可以显著增强Cx43总蛋白的表达(P<0.01);5mmol/L VPA预处理Hs578T细胞6h、12h和24h,可以显著增强Cx43总蛋白的表达。细胞免疫荧光结果显示VPA (1.25～5mmol/L)作用Hs578T细胞24h,可显著增强细胞胞膜Cx43蛋白的表达；5mM VPA预处理Hs578T细胞6h、12h和24h,可显著增强胞胞膜Cx43蛋白的表达。Western blotting结果显示VPA(0.625、1.25.2.5、5、10mM)处理Hs578T细胞24h,可以显著降低Src激酶的表达(P<0.01)；5mM预处理Hs578T细胞6h、12h和24h,可以显著降低Src激酶的表达(P<0.01)。提示,VPA可以通过增强Hs578T细胞Cx43总蛋白的表达和胞膜Cx43的表达而增强细胞GJ功能；也可能通过抑制Src激酶表达而增强GJ功能。MTT检测结果显示PP2在0～10mmol/L的浓度范围内并不影响细胞存活率。细胞接种荧光示踪结果显示PP2(1～8μmol/L)处理Hs578T细胞24h,可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递(P<0.01)。与对照组相比,PP2处理后细胞的荧光传递功能分别增加了60.12%、100.24%、120.14%和170.21%；8μmol/LPP2预处理Hs578T细胞6h、12h和24h,可以显著增强GJ介导的细胞间荧光传递功能(P<0.01)。与对照组相比,VPA预处理不同时间后细胞的荧光传递功能分别增加了41.21%、70.23%和122.13%。提示,在Hs578T细胞中PP2可以显著增强GJ功能。Western blotting结果显示PP2(1～8μmol/L)处理Hs578T细胞24h,可以显著降低Src激酶的表达(P<0.01)；8μmol/L PP2预处理Hs578T细胞6h、12h和24h,可以显著降低Src激酶的表达(P<0.01).PP2(1～8μmol/L)处理Hs578T细胞24h,对Cx43蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。提示,在Hs578T细胞中抑制Src激酶表达可以显著增强GJ功能。综合上述结果表明,在Hs578T细胞中VPA可以通过增强Cx43蛋白的表达和抑制Src激酶的表达而增强细胞GJ功能。结论：1.在Hs578T细胞中VPA可以通过增强细胞GJ功能而显著增强ADM的细胞毒性。2.在Hs578T细胞中VPA可以通过增强细胞GJ功能而显著增强ADM诱导的细胞凋亡作用。3.在Hs578T细胞中,GJ功能的增强与Cx43蛋白表达增加及Src激酶表达抑制有关。