第一部分ST09设计合成、体外活性检测及肝毒性评价目的：血管性痴呆(vascular dementia, VaD)是一种严重威胁中老年人群身体健康和生活质量的神经系统重大疾病。本课题组的前期研究采用多靶点配体(multi-target-directed ligands. MTDLs)的分子构建策略,选用经典药物他克林(tacrine)作先导化合物,在保持乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)抑制活性的基础上,引入巯基官能团,并制备成“前药”形式,合成了一系列新的多功能化合物。本课题选择其中效果最好的化合物ST09,继续改进其合成路线并初步评价其药理毒理作用,探索其用于治疗血管性痴呆的可能性。方法：化学合成、核磁共振、质谱分析、体外ChE活性筛选、体外细胞保护活性评价、类药性分析、电子自旋共振技术、体内肝毒性评价、HE染色。结果：优化他克林衍生物前药分子ST09的合成方法,扩大合成量,总收率保持在50-60%,其化学结构经波谱解析得到确证。体外药代动力学结果显示,作为前药分子的ST09经全血孵育后,会迅速转变为脱乙酰基的他克林巯基衍生物的形式(ST10),30min内的转化率可以达到96.72%。体外胆碱酯酶活性测试显示,ST09和ST10都基本保留了母药tacrine对AChE的抑制活性,对BuChE的抑制作用稍微减弱。PC12细胞活性实验结果显示1-30μM ST09对PC12细胞几乎无细胞毒性,对H202诱导的氧化损伤具有较好的保护性。大鼠体内肝毒性分析发现,ST09给药组(3.45mg/kg)大鼠血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase或glutamic-oxalacetic transaminase,AST/GOT)和谷丙转氨酶(alanine transaminase或glutamic-pyruvic transaminase, ALT/GPT)水平与对照组无显著差异,都处于正常值范围；肝脏HE染色结果也与之一致,各组均未表现出肝细胞损伤。与同等摩尔浓度的tacrine相比,ST09不引起Hepg2细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的升高,且其脱乙酰基活性形式ST10具有显著的体外自由基清除活性。通过Pallas3.3软件分析ST09化学结构,结果显示ST09满足lipinski类药性五规则(rule of five, Ro5);而且该化合物具有良好的血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)透过性(TPSA值为71.09A2),能够实现中枢靶向性。结论：相对于tacrine,前药ST09及其活性体内代谢产物ST10的乙酰胆碱酯酶抑制活性未发生显著改变,但其抗氧化和神经保护活性显著增加,且对于肝脏细胞的毒性也明显降低,说明巯基基团的引入产生了“增效减毒”的效果。第二部分ST09对血管性痴呆大鼠认知行为的影响目的：VaD约占痴呆患者总数的20-30%,是因各种类型的脑血管病所致的认知功能障碍而引起的获得性智能损害综合征。永久性双侧颈总动脉结扎(permanent occlusion of bilateral common carotidarteries,2-VO)模型是目前国内外公认的研究VaD的建模方法之一。为评价他克林巯基衍生物ST09对VaD的治疗效果,本课题观察2-VO所致VaD模型大鼠行为学的改变以及大脑皮层和海马病理学特征变化,研究他克林巯基衍生物ST09对VaD大鼠空间学习和记忆损伤的影响。方法：选择多奈哌齐(Don)作为阳性对照药。将健康雄性大鼠随机分为六组：假手术(Sham)组、模型组(Model+溶媒)、阳性对照组(Model+Don)、给药组(Mode+-ST09低、中、高)三个剂量组。采用2-VO法致大鼠慢性前脑灌注不足,建立学习记忆损伤的血管性痴呆模型。术后1w开始每天腹腔给药,Sham组和Model组给予生理盐水,Don组给予0.30mg/kg/day, ST09低、中、高三个剂量组按1.73mg/kg/day,3.46mg/kg/day和6.92mg/kg/day,连续给药6w后,进行大鼠Morris水迷宫有关空间学习和记忆的行为学检测。应用HE染色观察皮层和海马组织病理学改变。结果：术后7w,在定位航行实验中,Model组大鼠逃避潜伏期明显长于Sham组[F(1,16)=25.251,P<0.01]；与Model组相比,ST09中、高治疗组大鼠潜伏期明显缩短[F(1,25)=12.845,P<0.001]。随着训练天数的增加,各组大鼠逃避潜伏期逐渐缩短,具有显著的统计学差异[F(3,141)=82.902,P<0.01]。在day×group交互影响中,结果显示所设置的给药方案随着训练进行具有显著差异[F(15,141)=1.827,P=0.036]。在隐藏平台后的第1d训练中,各组逃避潜伏期并无显著性差异F(5,47)=0.576,P=0.718)。第2-4d,各组逃避潜伏期具有显著性差异[day2:F(5,47)=4.967, P=0.001; day3:F(5,47)=6.670, P<0.001;day4:F(5,47)=11.228,P<0.001]。在训练第2-4d,与Model组相比,Sham组和ST09中剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)；在第3-4d,ST09高剂量组大鼠逃避潜伏期也明显缩短(P<0.05)。与Model组相比,低剂量ST09组大鼠逃避潜伏期无显著性差异。在空间探索实验中,与Model组相比,Sham组大鼠在目标象限的时间和路程均明显延长(P<0.05)；ST09中、高剂量组在目标象限的时间均明显延长(P<0.05or0.01)；ST09中剂量组在目标象限的路程明显延长(P<0.05)。HE染色结果显示,Sham组大鼠皮层和海马CAl区神经元细胞排列整齐、形态完整,核仁清晰。Model组大鼠皮层和海马脑区神经元丢失,胞核固缩、浓染,出现明显炎性细胞浸润、胶质细胞增生和血管增生。ST09治疗组和Don组此类现象得到明显改善。结论：ST09对VaD大鼠学习和记忆能力有明显改善作用,并且大鼠皮层和海马组织病理学改变程度大大减轻,表明ST09对VaD具有治疗作用。第三部分ST09改善血管性痴呆大鼠认知障碍的机制目的：VaD患者认知功能障碍与脑部缺血缺氧引起的胆碱能神经功能损伤、氧化应激增加和能量供应不足都有密切关系。本课题通过观察药物对VaD模型大鼠海马和皮层组织胆碱能系统损伤、氧化应激、神经细胞凋亡水平和脑部葡萄糖代谢的影响,探讨ST09治疗VaD相关认知障碍的作用机制。方法：将经2-VO造模、给药和行为学测试后的SD大鼠断头处死,取血清及海马、皮层组织。选取Sham组、模型组、阳性对照组和中剂量给药组(3.46mg/kg)四组样本做后续研究。血清、海马和皮层组织匀浆液做抗氧化和氧化损伤指标、蛋白巯基含量以及胆碱酯酶活性检测。以Western Blotting检测海马和皮层凋亡相关蛋白Bax、Bc1-2和活性Caspase-3表达。以小动物18F-FDG PET成像技术检测四组SD大鼠(给药6w后)进行皮层和海马脑区的葡萄糖代谢情况。结果：给药6w后,Model组大鼠海马和皮层脑区SOD活性显著低于Sham组,ST09(3.46mg/kg)组缺血损伤后的SOD活性得到显著提高(P<0.05vs model)。 Model组大鼠海马和皮层MDA水平较Sham组显著升高,而ST09(3.46mg/kg)组明显逆转了这两个脑区的MDA增加(P<0.01)。Model组大鼠血清、海马和皮层蛋白巯基含量较Sham组显著降低,ST09组则得到显著改善(P<0.01),并且ST09组血清和脑组织中蛋白巯基含量明显高于阳性对照药Don组(P<0.01)。相对于Sham组,Model组大鼠皮层和海马区凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值显著降低,活性caspase3蛋白表达显著升高。ST09(3.46mg/kg)明显逆转缺血损伤所致的凋亡改变,皮层Bc1-2/Bax表达从0.632±0.111增至1.697±0.131(P<0.05),海马从0.238±0.048增加到0.756±0.068(P<0.01)；皮层区活性caspase-3表达水平从0.706±0.054降至0.475±0.042(P<0.01),海马从0.821±0.036降至0.483±0.076(P<0.01)。小动物18F-FDGPET成像结果显示,相对于对照组,模型组大鼠PET示踪剂的分布显著减少(P<0.01),说明慢性脑缺血造成皮层和海马组织葡萄糖代谢减少,而ST09组示踪剂分布明显增强(P<0.05),并超过阳性对照药Don组,提示ST09具有更好的脑代谢改善作用。结论：ST09明显改善VaD大鼠海马和皮层的抗氧化、抗凋亡系统功能,保护脑部的氧化损伤和胆碱能系统损伤,同时还大大促进缺血脑区葡萄糖代谢,增加了脑区的能量利用,这些因素共同参与该化合物对VaD大鼠空间学习和记忆能力的改善。以上结果提示,ST09具有潜在的抗VaD的临床开发价值。