吉林白鹅肠道纤维分解菌分离鉴定的研究

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试验选择60日龄健康吉林白鹅20只,饲喂的粗饲料以羊草为主,日粮含粗纤维8%,采用地面平养饲养4周,饲养试验结束后,取体重达4kg以上15只进行屠宰,屠宰后用0.25%的新洁尔灭对鹅进行消毒。在无菌条件取十二指肠、空肠、回肠、盲肠食糜及其内壁刮取物。在试管中进行富集培养,42℃培养7~10d,在分离平板上反复划线分离,直至长出单菌落,将其中生长旺盛的菌株接入斜面保藏。共筛选出42株,其中回肠食糜中分离出3株,内壁刮取物中7株;盲肠食糜中出分离8株,内壁刮取物中分离出20株;从空肠食糜中分离4株。完全厌氧条件并未分离出菌株。将初筛出的菌株通过蛇形划线接种于CMC-Na斜面培养基上,42℃培养2d进行增殖,将增殖后的菌株用接种针点种于CMC-Na平板上,42℃培养2d,用1mg/L刚果红染色5min,倾去染液,测溶解圈直径(mm),并计算酶的相对活性A=溶解圈直径/天数。通过对比,选择出H/C比值较大的菌株进行复筛,共分离出18株,回肠食糜中分离出1株,内壁刮取物中3株;盲肠食糜中4株,内壁刮取物中10株。复筛采用摇瓶产酶发酵培养,42℃,48h选出酶活最高,且生长很旺盛的菌株4株,回肠内壁刮取物1株,盲肠内壁刮取物3株,对四株菌进行酶学性质研究,体外模拟盲肠条件研究其对三种牧草粗纤维的降解率。对四株菌进行细菌学、生理生化学及分子生物学(16SrDNA测序同源性比较)鉴定。结果表明:吉林白鹅回肠、盲肠内存在着一组产纤维素酶的细菌,其可以不同程度的利用饲料中的粗纤维;4株菌都在温度为42℃时,时间为48h产酶量达到高峰。通过优化培养,在羧甲基纤维素钠、豆秆粉等组成的液体发酵培养基中,来自盲肠菌株M6产生的纤维素酶在温度为60℃、pH为4.0时酶活力最高达到了51.4U,来自回肠的菌株H1产生的纤维素酶在温度为60℃、pH为6.0时酶活力达到41.4U;当模拟鹅盲肠条件(人工盲肠液)进行体外试验时,分别接种不同菌株的三种牧草,其中接种H1XM2XM6菌株苜蓿组粗纤维降解率最高达到7.87%;菌株对3种牧草中苜蓿的粗纤维降解率略高于其它2种牧草,且接种复合系菌株的牧草粗纤维的降解率略高于单一菌株;根据菌株M3菌落形态、菌体形态,生化特性以及16S rDNA序列同源性比较,菌株M3的16S rDNA部分序列与志贺氏菌(AM184231.1)的部分序列同源性有99%的一致性,初步鉴定为肠杆菌科志贺菌属。菌株M6的16S rDNA序列同源性比较发现,该菌株与枯草杆菌同源关系较近,同源性达到92%,但其微生物学性质不符,因而有必要对该菌株选择特异性更高的引物进行16S rDNA鉴定。
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