棉花作为世界上最重要的自然纤维和油料作物,产区遍布热带和亚热带地区。棉花用途多样,可应用于纺织、食品、造纸等方面,具有很高的经济价值。而且,由于棉纤维是外表皮单细胞突起并高度增长加厚的结果,成熟的棉纤维细胞壁的纤维素含量高达95%,这为研究细胞伸长、纤维素合成以及细胞壁发育提供了较为理想的模式系统。棉纤维发育可以分为起始、伸长、次生壁加厚和脱水成熟四个阶段,起始期影响棉纤维密度,伸长期影响长度,次生壁加厚期影响棉纤维品质。我们从研究影响棉纤维次生壁发育的基因入手,试图揭示这些基因在棉纤维发育中的作用机制,为提高棉纤维产量和品质提供理论基础。在本实验室先前工作的基础上,本文研究GhKNL1和GhMYBL1两个基因在棉纤维发育过程中的调控作用。围绕GhKNL1 RNAi转基因棉花展开对GhKNL1功能的进一步分析；同时将对于GhMYBL1的功能研究从模式植物拟南芥回归到本体植物棉花中来,结合一些生化实验,分析其在棉纤维发育中发挥的功能,取得的研究结果如下：1、GhKNLl转录因子在棉纤维发育过程中发挥负调控作用为了进一步研究GhKNL1基因在棉纤维发育过程中发挥的功能,构建了该基因的RNA干扰(RNAi)载体,转化棉花,获得转基因棉花植株及其后代株系。对T1代转基因棉花进行表型分析,结果表明,与野生型相比,GhKNL1 RNAi转基因棉花纤维显著伸长；去除长绒后,发现短绒的长度也有较为明显的增加；脱绒后的种子在大小上有一定程度的变大。由此说明,GhKNLl参与调控棉纤维发育过程,可能是作为转录抑制因子在棉花纤维发育中发挥负调控作用。2、GhKNLl调控一些棉纤维细胞次生壁相关基因的表达提取GhKNL1 RNAi转基因棉花开花20天后(20 DPA)纤维RNA,利用荧光定量RT-PCR技术分析棉纤维伸长和次生壁加厚相关基因的表达量变化情况。结果表明,与野生型相比,棉纤维伸长相关的1,3-β-G基因表达略有上升,XTH基因表达量下调,而一些参与次生壁加厚期的基因表达量显著上调,这说明抑制GhKNL1基因表达会影响纤维细胞次生壁发育相关的基因表达,从而影响棉纤维细胞次生壁加厚发育。3、GhMYBLl载体构建及棉花转化本实验室在先前的工作中克隆鉴定了棉花MYBL1基因,并在拟南芥中初步分析了该基因的功能。为了进一步研究GhMYBL1在棉纤维发育中的作用,构建了CaMV 35S启动子驱动的GhMYBL1过量表达载体和该基因自身启动子驱动的GhMYBL1过表达载体,GhMYBL1 RNAi载体,以及GhMYBL1与GFP融合表达载体,用于转化棉花。由于棉花转化效率较低,且需要很长时间的愈伤组织继代培养才能产生胚性愈伤组织及再生苗,因此这项工作尚在进行中。其中,两个GhMYBL1过量表达载体转化棉花,已获得转化愈伤组织,经过长时间继代培养,预期可能在近期内获得转基因胚性愈伤组织及再生小苗；GhMYBL1::GFP融合表达载体转化棉花,已经获得4个胚性愈伤组织细胞系,即将出苗；GhMYBL1 RNAi载体转化棉花,获得12个胚性愈伤组织细胞系,其中6个胚性细胞系再生出苗。对所获得的再生植株进行鉴定,在40棵小苗中,有25棵为转基因阳性植株。将这些转基因棉花植株移栽到土中,继续生长发育,部分植株能够正常发育,开花结实,收获到T1代种子。将T1代种子萌发栽种在土中,初步分析了转基因棉花植株表型,相关的实验分析正在进行中。4、GhMYBLl影响CelAl启动子和IRX12启动子活性为研究GhMYBLl调控的基因类型以及调控方式,进行了拟南芥杂交实验,实验用的转基因植株为PC1301-CelAlp::GUS(CelAl启动子与GUS融合)和PC1301-IRX12p::GUS(1RX12启动子与GUS融合)转基因拟南芥和GhMYBL1过表达转基因拟南芥。实验结果表明,PC1301-CelAlp::GUS转基因拟南芥与GhMYBL1过表达拟南芥杂交后GUS信号增强,而PC1301-IRX12p::GUS与GhMYBL1过表达拟南芥杂交后GUS信号变弱。上述结果说明GhMYBL1可以调控CelA1和IRX12这两个启动子的活性。5.GhMYBLl可以在体外直接作用于CelA1启动子的SMRE顺式元件为了研究GhMYBL1转录因子是否能通过对顺式元件SMRE基序的识别来调控目的基因表达,进行了凝胶迁移(EMSA)实验。首先,在大肠杆菌中诱导表达GhMYBL1蛋白,通过纯化得到纯度较高的GhMYBL1蛋白；再根据CelAl启动子序列中的SMRE序列设计探针,进行EMSA实验。结果显示,GhMYBL1蛋白能够直接结合CelA1启动子中的SMRE元件,从而影响其启动子活性,调控该基因的表达。