前言δ-catenin作为p120亚家族中的重要成员,与p120的结构及作用相似,具有十个Arm重复序列,与p120同在细胞膜上的E-cadherin拥有共同的JMD（juxtamembrane domain）结合位点,可以通过与E-cadherin（E-cad）直接结合形成E-cadherin/catenin复合体,调节细胞间的粘附。同样,δ-catenin也可以入核并与kaiso相结合。据报道,在神经元内,δ-catenin参与信号传递,还可以通过对SmallGTP酶（例如RhoA、Cdc42、Rac1）活性的调节来影响细胞骨架生长。SmallGTP酶是Ras超家族中的小GTP结合蛋白,它们在代谢中存在活化型（与GTP结合）和失活型（与GDP结合）两种形态,二者就像分子开关般动态调节装配actin细胞骨架,并引发细胞的形态,趋化和细胞运动等不同的生物反应。因此,我们推测在肺癌组织中,δ-catenin与SmallGTP酶之间很可能存在着联系。在本研究中,我们对135例NSCLC样本中δ-catenin及SmallGTP酶的表达情况进行检测,并探讨了它们的表达与临床病理因素的关系。同时,在肺癌细胞系中分别过表达或干扰δ-catenin进而影响肺癌细胞的侵袭和转移。材料与方法一、组织标本与病人资料135例具有随访资料的原发性肺鳞癌、腺癌（均来自1998～2005年在中国医科大学第一附属医院行手术切除的标本蜡块）。其中71例男性,64例女性,平均年龄为58岁。根据WHO肺肿瘤组织学2004年分类标准：其中鳞癌61例,腺癌74例。高分化32例,中分化64例,低分化39例。按照International Union Against Cancer （UICC）于2002年修订的肿瘤pTNM分期标准：Ⅰ期22例,Ⅱ期46例,Ⅲ期59例,Ⅳ期8例。对这些病例中的70例进行了术后随访,生存时间是从手术日期到由于复发或转移而死亡的日期（或末次随访日期）为止。此外,为提取蛋白及RNA,另取30例新鲜肺癌及癌旁正常肺组织。二、免疫组织化学染色对135例NSCLC标本采用Streptavidin-Peroxidase （SP）免疫组织化学方法,检测δ-catenin与SmallGTP酶的表达及其与各临床病理因素之间的关系,及70例随访标本中δ-catenin与SmallGTP酶的表达与患者预后的关系。观察δ-catenin在肿瘤组织的表达,计数400个肿瘤细胞并计算其中阳性染色细胞的百分数。δ-catenin的评分标准：免疫染色的强度（0=negative, 1=weak, 2=moderate,3=strong）;免疫染色的阳性肿瘤细胞数（0=absent,1=1～25%,2=26～50%,3=51～75%,4=≥76%）。最终分数即为两项评分的乘积。为了便于统计,将评分结果分为两组：阴性表达<2；阳性表达≥2。对SmallGTP酶进行免疫组化检测,每张切片随机选取5个高倍视野,每个视野计数100个瘤细胞,RhoA、Cdc42和Racl胞浆表达（-）⁺定义为表达正常,将（++）⁺⁺⁺定义为过度表达。将δ-catenin阳性表达和smallGTP酶的过表达同时出现的情况,称为协同表达。三、细胞培养,质粒构建与转染人肺腺癌细胞系A549、SPC-A-1 （Manassas, VA, USA）,分别培养于含10%灭活胎牛血清,2.3g／L NaHCO3、100U／ml青链霉素的RPMI 1640或高糖DMEM（GBICO Inc., Los Angeles, CA, USA）培养液中。（1）δ-catenin cDNA质粒构建与转染：含人源性全长δ-catenin cDNA的质粒（pCMV5-FLAG/δ-catenin）,用脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen, USA）导入δ-catenin表达较低的SPC细胞系,并以空载体作为阴性对照。（2）δ-catenin siRNA质粒构建与转染：将设计的δ-catenin siRNA （5’-CUACGUUGACUUCUACUCAUU-3’;5’-UGAGUAGAAGUCAACGUAGUU-3’）,利用脂质体Lipofectamine 2000导入δ-catenin表达较高的A549细胞系,同时以非特异性的乱序siRNA作为阴性对照。四、Western Blotting与RT-PCR应用Western Blotting与RT-PCR检测肺癌及癌旁正常肺组织中δ-catenin与SmallGTP酶的蛋白和mRNA表达情况。五、RhoA, Cdc42和Racl活性的检测在过表达或敲除δ-catenin肺癌细胞系中,通过Pull-Down和比色法测定small GTPases （RhoA、Cdc42、Rac1）活性的变化。六、细胞侵袭能力的测定通过基质胶侵袭试验分别检测过表达与敲除δ-catenin后的细胞侵袭能力。结果一、肺癌组织中,δ-catenin的阳性表达与RhoA、Cdc42和Racl的过表达有较好的一致性和相关性在135例非小细胞肺癌病例中,δ-catenin阳性表达为86例,阴性表达为49例,阳性表达率为63.70%（86／135）：RhoA、Cdc42和Racl在肺癌组织中的表达明显增强,其过表达率分别为63.70%（86／135）,67.41%（91／135）和65.19%（88／135）。并且它们的过表达与δ-catenin的阳性表达具有较好的相关性（P<0.001；P<0.001；P<0.001）。分析这四种指标同时出现阳性表达或过表达（协同表达）与临床病理因素的关系后发现：肺腺癌中的协同表达率为52.70%（39／74）,明显高于于鳞癌的34.43%（21／61）（P<0.05）；Ⅲ-Ⅳ期的协同表达率为58.21%（39／67）,显著高于Ⅰ-Ⅱ期的30.88%（21／68）（P<0.05）；有LN转移的病例协同表达率是52.75%（48／91）,也明显高于无LN转移病例的27.27%（12／44）（P<0.05）。但研究中未发现协同表达与患者年龄、性别和分化程度有明显关联（P>0.05）。二、δ-catenin的阳性表达和RhoA、Cdc42和Racl的过表达与患者的不良预后相关当δ-catenin的阳性表达和RhoA、Cdc42和Racl过表达时,患者的平均生存时间和5年生存率明显低于它们在正常表达时患者的平均生存时间和5年生存率（P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05,）。因而,δ-catenin的阳性表达和RhoA、Cdc42和Racl的过表达与患者的不良预后明显相关。三、与正常肺组织中相比,肺癌组织中δ-catenin和SmallGTP酶的表达明显增强RT-PCR结果显示：δ-catenin、RhoA、Cdc42和Rac在癌旁正常肺组织中正常表达,而在肺癌组织中表达明显增强。Western Blot结果支持了我们在RT-PCR中结果,在肺癌组织中δ-catenin的表达明显增强,而RhoA, Cdc42和Racl的表达也明显增强。四、过表达δ-catenin使RhoA活性降低的同时升高了Cdc42和Rac1的活性；而沉默δ-catenin后则产生相反的影响我们分别检测了过表达与沉默δ-catenin后RhoA、Cdc42、Rac1的活性变化。显示在SPC细胞系过表达δ-catenin后,总Cdc42和Racl蛋白水平虽然没有变化,但pull-down检测显示Cdc42/Rac1活性却明显增高（P<0.05）,且G-LISA分析显示RhoA活性明显下降（P<0.001）；在A549细胞系中沉默δ-catenin后,总Cdc42和Racl蛋白虽然也没变化,但GTP-Cdc42/Rac1却显著降低（P<0.05）,RhoA活性增加（P<0.05）。五、过表达δ-catenin促进肺癌细胞的侵袭,而δ-catenin的下调则抑制侵袭利用血清刺激的基质胶侵袭实验检测体外过表达或沉默δ-catenin后肺癌细胞侵袭能力的变化。过表达δ-catenin后,平均侵袭的细胞数明显高于对照组；而在沉默δ-catenin后,平均侵袭的细胞数显著低于相应对照组。以上数据揭示了δ-catenin的上调可以促进肺癌细胞侵袭能力；而内源性δ-catenin的下调则明显抑制肿瘤细胞侵袭能力。结论δ-catenin在肺癌中的阳性表达和RhoA、Cdc42和Racl表达增强具有明显的相关性和一致性,并且它们的这种协同表达与肺癌的分期,病理分型和淋巴结转移和患者的不良预后显著相关。当δ-catenin增强时,改变smallGTP酶的活性,从而促进肿瘤侵袭和转移。但是,在肺癌组织中它们之间的具体调节机制还有待于我们去进一步证实。