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羊口疮是一种分布范围很广的人畜共患病,不仅给畜牧业造成严重的经济损失,而且威胁着人类的健康。ORFV(ORFV)是羊口疮的病原体,属于痘病毒科副痘病毒属。ORF059基因位于病毒基因组中间的高度保守区,是主要的肝素结合活性蛋白,可以和细胞表面的硫酸乙酰肝素受体结合,与ORFV的吸附和侵入有关,同时也是ORFV的囊膜蛋白的组成成分,可以使宿主产生中和抗体。实验一,以pEGFP-N1为载体,构建重组质粒pEGFP-ORF059-N1,转染293T细胞,用荧光显微镜观察荧光蛋白,以本实验室制备的兔抗ORFV-059多克隆抗体作为一抗,进行Western blot分析。再将实验组和对照组进行转录组测序,分析差异基因及其富集的通路。结果表明,转染了重组质粒pEGFP-ORF059-N1的293T细胞可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染了空质粒pEGFP-N1的293T细胞也可观察到荧光,而293T细胞未观察到荧光,Western blot只检测到转染了重组质粒pEGFP-ORF059-N1的293T细胞中有融合蛋白,大小为64kDa。转录组测序分析出差异基因有499个,主要富集在免疫反应、蛋白结合、受体结合、蛋白质二聚化活性、PI3K/Akt信号通路、B细胞受体信号通路、趋化因子信号通路等通路。实验二,以慢病毒为载体构建重组质粒,感染牛肾细胞,进行荧光显微镜观察和Western blot分析。后续进行转录组测序分析差异基因和富集通路。结果表明牛肾细胞没有荧光,感染了带有GFP标签的慢病毒的牛肾细胞和带有GFP标签和ORF059外源基因的慢病毒的牛肾细胞可检测到荧光,Western blot只检测到带有GFP的ORF059外源基因的牛肾细胞有融合蛋白,大小为64kDa。转RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、蛋白磷酸化的调控、细胞粘附、PI3K-Akt信号通路、B细胞受体信号通路等。实验三,以实验二制备的重组慢病毒感染山羊成纤维细胞,并进行荧光显微镜和Westemblot分析,后续进行转录组测序分析。结果表明山羊成纤维细胞没有荧光,感染了带有GFP标签的慢病毒的山羊成纤维细胞和带有GFP标签和ORF059外源基因的慢病毒的山羊成纤维细胞可检测到荧光,Western blot只检测到带有GFP的ORF059外源基因的山羊成纤维细胞有融合蛋白,大小为64kDa。转录组测序分析表明:有407个差异基因,主要富集在转录调控、细胞粘附、凋亡过程的负调控、RNA聚合酶II启动子转录的调控、PI3K/Akt信号通路等。本实验从蛋白水平和分子水平初步研究了ORF05 基因的功能,为研制羊口疮基因工程亚单位疫苗奠定了基础,也为深入研究羊口疮的致病机制提供了重要的依据。