研究背景癌症是世界上最常见的死亡原因,在所有癌症中肺癌是病死率最高的,肺癌的病死率高是由于肺组织中癌细胞的增殖失控和早期转移。目前认为,长期暴露于烟草烟雾、遗传因素、空气污染是肺癌发生的主要原因。众多研究表明,肺癌通过不同遗传途径、分子表达谱及治疗反应性呈现出明显的多态性和遗传异质性,现已确定许多基因和蛋白质在癌症发生的复杂信号通路中发挥至关重要的作用。然而,目前有关肺癌发生的确切机制仍知之甚少。干扰素诱导跨膜蛋白(interferon induced transmembrane protein,IFITM)基因家族是1984年首次在IFN诱导的神经母细胞瘤的cDNA中被发现,到目前为止,人类已发现五个 IFITMs(IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 及 IFITM10)亚基因。IFITM蛋白家族的成员均由大约130个氨基酸构成,有两个跨膜蛋白区域穿插在一个保守的细胞质区。以往的研究表明,他们属于一个小鼠基因的家族成员,由2个短的具有高度相似性但由不同N末端和C端的核心序列的跨膜结构域蛋白组成。人类的同源基因(IFITM1,IFITM2,IFITM3)都聚集在11号染色体上,IFITM家族的主要功能是调节免疫功能,抑制病毒合成或复制,调节成骨细胞骨矿化,IFITM蛋白还被认为在细胞周期控制和细胞凋亡中起作用。其中,IFITM3又称1-8U,首先在结肠肿瘤及溃疡性结肠炎患者的结肠粘膜中分离,研究证实其可作为溃疡性结肠炎相关性结肠癌的首选标记物,并且IFITM3的表达与大肠癌的转移和预后呈正相关;IFITM3的表达水平也被证实在星形胶质细胞瘤细胞中的水平显著高于正常小鼠的星形胶质细胞水平,IFITM3上调可影响神经胶质瘤细胞的增殖浸润,已被认为是脑胶质瘤发生和侵袭的关键因素;其它研究显示IFITM3在头颈部鳞状细胞癌、食管鳞癌、胃癌、肝癌组织中过度表达,预示患者预后不良,在上述癌组织中IFITM3的高水平表达促进癌细胞的增殖,并与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及远处转移等密切相关,而基因敲除技术能显著下调IFITM3的mRNA及其蛋白水平,显著抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞周期停滞、促进细胞衰老和凋亡;IFITM3蛋白在浸润性乳腺癌中高表达,并且与雌激素受体和孕激素受体水平显著相关。因此,IFITM3被认为是癌症发生发展的重要参与者,可能通过直接或间接途径抑制癌细胞的凋亡,促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。目前关于IFITM3在癌症发病机制中所发挥的具体功能和潜在机制仍不清楚,而对于IFITM3在肺癌中的研究目前更是鲜为人知。在人们日益追求高质量生活的今天,癌症的早发现、早治疗显得尤为重要,进一步研究IFITM3在癌症进展中的作用机制具有重要意义。本课题以IFITM3基因为切入点,通过检测IFITM3蛋白在肺腺癌组织中表达水平,分析肺腺癌组织中IFITM3表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系,并以此为基础,通过慢病毒介导的基因沉默及过表达技术,沉默及过表达肺腺癌细胞IFITM3基因,观察其对肺腺癌细胞株生长、迁移及侵袭的调节作用,以及上皮间质转化(EMT)是否也发生于肺腺癌的进展过程中,基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)在其中的具体作用如何,p38-MAPK信号通路是否在肺腺癌进展中发挥了积极作用,p38-MAPK信号通路特异性激动剂TNF-α和抑制剂SB203580是否可改变这一进程,同时通过裸鼠成瘤能力进一步验证IFITM3基因的促细胞增殖作用。研究目的明确IFITM3在肺腺癌发生中的作用,通过分析IFITM3蛋白在肺腺癌组织的表达,观察沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞生长、迁移、侵袭、细胞凋亡和细胞周期分布的影响,探讨IFITM3在肺腺癌进展中的作用机制,并为寻找新的生物学标志物及新的治疗方法奠定基础。研究方法1.肺腺癌癌组织中IFITM3蛋白的表达:收集50例肺腺癌组织,采用免疫组织化学染色方法检测肺腺癌组织中IFITM3的表达,分析肺腺癌中IFITM3表达及其临床意义。2.采用实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA及蛋白表达水平,选择高表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因沉默技术,构建IFITM3特异性沉默表达载体,转染至高表达IFITM3的肺腺癌细胞株;选择低表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因过表达技术,构建IFITM3特异性过表达载体,转染至低表达IFITM3的肺腺癌细胞株,通过实时定量PCR及Western blot检测IFITM3基因沉默及过表达的效率。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:通过软琼脂培养克隆形成实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞克隆形成能力的影响。4.通过流式细胞仪检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞周期分布。Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞周期蛋白的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移的影响:通过Transwell侵袭实验及Transwell迁移实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞侵袭及迁移能力的影响;6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的影响:将沉默IFITM3基因的H1299细胞及过表达IFITM3基因的A549细胞和对照组H1299细胞,分别接种于裸鼠左侧腋下接种观察出瘤,接种后第30天处死,测量瘤重量及瘤体体积。7.通过Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因后MMP-2及MMP-9的表达情况;Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因对EMT标记物Vimentin、Snail及E-cadherin表达的影响。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用:Western blot检测沉默IFITM3基因组加入p38-MAPK通路激活剂TNF-α后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况;过表达IFITM3基因组加入p38-MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况。研究结果:1.IFITM3蛋白在人肺腺癌中的表达及临床意义结果表明,50例肺腺癌组织中的IFITM3蛋白表达呈阳性的有41例(82.00%)。TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)患者肺癌组织内IFITM3的表达高于TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期)患者;在有淋巴结转移患者肺癌组织内IFITM3表达高于无淋巴结转移病例,提示IFITM3蛋白在肺癌组织内的表达与淋巴结转移和TNM分期有关。2.肺腺癌细胞IFITM3的表达及转染效率。采用了实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA表达水平,Western blot检测各细胞株IFITM3的蛋白表达水平。结果显示,IFITM3在人支气管上皮样细胞16HBE仅有少量表达,在H1299和H1975细胞表达较高,在H1395和A549细胞表达较低,因此,选择H1299和H1975细胞行基因沉默,选择H1395和A549细胞行基因过表达进行下一步研究。并通过实时定量PCR及Western blot检测转染效率,1v-shIFITM3转染H1299和H1975细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达被明显的抑制;过表达质粒转染H1395和A549细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达则明显增加。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:采用软琼脂培养克隆形成实验显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞克隆形成能力明显下降,提示沉默IFITM3能够抑制肿瘤细胞生长;过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞克隆形成能力明显增强,提示过表达IFITM3能够促进肿瘤细胞生长。4.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布、细胞周期蛋白及肺癌细胞早期凋亡的影响流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示随着IFITM3的下调,处在G0/G1期的细胞数量显著增加,而在G2/M期及S期的细胞减少,这些结果表明,沉默IFITM3表达,可将H1299和H1975细胞阻滞于G0/G1期,从而抑制肿瘤细胞的增殖;随着IFITM3的过表达,处在G0/G1期的细胞数量显著减少,而在G2/M期及S期的细胞增加,过表达IFITM3促进H1395和A549细胞的增殖。Western blot检测细胞周期蛋白结果显示沉默IFITM3表达,可降低H1299和H1975细胞CDK4及cyclin D1的表达,而P21的表达升高;过表达IFITM3,可升高H1395和A549细胞CDK4及cyclin D1的表达,P21则表达降低。Annexin V-FITC及PI复染法流式细胞仪检测肺癌细胞早期凋亡结果显示沉默IFITM3促进H1299和H1975细胞早期凋亡,过表达IFITM3抑制H1395和A549细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移能力的影响Transwell侵袭实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞侵袭能力明显降低,过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞侵袭能力明显增强。Transwell迁移实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞迁移能力明显降低。过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞迁移能力明显增强。6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的的作用沉默IFITM3基因可抑制H1299细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强A549细胞裸鼠成瘤能力。7.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测IFITM3基因对MMP-2及MMP-9的表达结果显示,沉默IFITM3表达可降低H1299和H1975细胞MMP-2及MMP-9的表达,过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞MMP-2及MMP-9的表达。Western blot检测IFITM3基因对EMT标记物的表达结果显示,沉默IFITM3可降低H1395和H1975细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达升高;过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达降低。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用Western blot实验结果表明沉默IFITM3基因,非磷酸化p3 8表达无明显改变,磷酸化p38的表达显著下降,在沉默IFITM3基因的H1299和H1975细胞中加入TNF-α,p38-MAPK通路激活后E-cadherin的表达降低,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达升高;过表达IFITM3基因,非磷酸化p38表达无明显改变,磷酸化p38的表达显著增加,在过表达IFITM3基因的H1395和A549细胞中加入SB203580特异性抑制p38-MAPK信号通路,E-cadherin的表达升高,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达显著降低,这些结果表明:IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导EMT的发生。研究结论1.IFITM3蛋白在肺腺癌组织内呈现高表达,并与淋巴结转移和TNM分期有关。2.沉默IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力下降,并促进其凋亡;过表达IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力上升,并减少其凋亡。3.沉默IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显降低,过表达IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显增强。4.沉默IFITM3基因可抑制肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力。5.沉默IFITM3基因导致MMP-2、MMP-9蛋白的表达降低,过表达IFITM3基因后MMP-2、MMP-9蛋白的表达升高,IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导上皮细胞间质转化的发生,从而促进肺癌细胞的侵袭和转移能力。以上结果提示IFITM3在肺腺癌细胞的增殖、侵袭、转移中发挥重要作用,IFITM3表达与肺腺癌的病情发展有关,IFITM3有望成为肺腺癌治疗的新靶点。