胶质瘤是脑部最常见的恶性肿瘤,尽管手术最大切除加放疗和化疗,但复发几乎不可避免,预后极差,平均生存期只有15-18个月。氩氦冷冻是近年来兴起的一种新的肿瘤微创靶向治疗手段,已经广泛应用于各种肿瘤的治疗,比如前列腺癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌及胶质瘤等。与单纯手术切除相比,冷冻治疗除了对肿瘤组织产生局部破坏以外,也可引起机体的抗肿瘤免疫反应并可减少肿瘤的转移,从而减少肿瘤的复发率。一直以来,中枢神经系统由于血脑屏障的存在,缺乏传统的淋巴管,MHC低表达及T淋巴细胞较少而被认为是免疫豁免区。然而,随着对中枢神经系统免疫的不断研究,中枢神经系统的免疫豁免不是绝对的,现在更多的是把中枢神经系统看成一个免疫特区,并可分为三部分：脑实质、脑室包括脉络从和脑脊液及脑膜。而脑室和脑膜的免疫反应与外周组织相似。因此,中枢神经系统可以产生免疫反应,这为中枢神经系统肿瘤的免疫治疗提供了理论基础。越来越多的数据表明,树突状细胞(DC)在中枢神经系统免疫反应中起着重要作用。树突状细胞是机体最强的抗原提呈细胞(APC),可有效提呈抗原并活化初始T细胞而产生抗肿瘤免疫反应,是肿瘤免疫反应的关键环节。正常情况下,DC以未成熟的状态存在于外周组织,未成熟DC吞噬抗原后将其加工、处理为抗原肽,载入MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子形成抗原肽-MHC分子复合物并表达于DC的表面,同时上调DC表面共刺激分子(CD80、CD86),黏附分子的表达形成成熟DC后,可识别并激活肿瘤抗原特异性T细胞,同时DC分泌IL-12等细胞因子而刺激T淋巴细胞增值,产生肿瘤杀伤效应。氩氦冷冻治疗肿瘤后,局部形成大量坏死组织,这些坏死组织作为肿瘤抗原被DC摄取,进一步促进T淋巴细胞活化增值是产生肿瘤特异性免疫反应的关键。研究表明,氩氦冷冻是产生组织坏死的一种有效方法,细胞坏死包括细胞膜及胞质的破裂及细胞器的释放。此过程对于体内免疫细胞是一个很强的活化信号。同时坏死又使细胞因子大量释放,使得抗原递呈细胞被活化的可能性增加。与传统热疗不同,冷冻疗法并不会对肿瘤内部的抗原肽产生大的破坏。这些相对较完整的肿瘤特异性抗原肽随着肿瘤细胞的裂解被释放到周围组织中,极易被体内抗原呈递细胞摄取并呈递给T淋巴细胞从而产生细胞免疫效应。近年来大量体内外的实验研究表明,肿瘤组织冷冻消融后的冻融产物可促进DC的成熟及其抗原递呈功能,并可有效激活T淋巴细胞产生抗肿瘤免疫反应。目前,肿瘤抗原致敏DC后形成的DC疫苗已经广泛应用于临床并取得了较好的疗效。DC疫苗的主要制备方法包括肿瘤抗原多肽致敏DC、肿瘤细胞的蛋白提取物致敏DC、DC与肿瘤细胞互相融合、肿瘤细胞提取的DNA或mRNA致敏DC、细胞因子或趋化因子基因修饰DC等。理想的肿瘤抗原DC疫苗应当是能够诱导针对多种肿瘤抗原表位的多克隆反应,而且不诱导自身免疫反应,无安全隐患,不受患者MHC的限制,制备和应用简单方便。而采用肿瘤细胞的裂解物致敏DC,可以克服因单一抗原诱发的免疫反应不能完全杀灭肿瘤细胞的缺陷,因此采用冻融裂解肿瘤细胞致敏DC制备的DC疫苗具有较好的应用前景。因此,基于树突细胞具强大的抗原呈递能力,本研究选用小鼠GL261胶质瘤细胞系作为研究对象,首先,利用氩氦冷冻冻融胶质瘤细胞,提取肿瘤抗原,致敏C57BL/6小鼠骨髓源DC,流式细胞仪检测DC表面分子的表达,证明冻融产物是否可促进DC的成熟,同时检测DC分泌的细胞因子的变化。提取小鼠骨髓T细胞与DC共培养,检测T细胞的增值活性,同时检测T细胞分泌IFN-γ的含量,以评价DC细胞的抗原递呈功能。将活化T细胞与GL261胶质瘤细胞共培养,检测不同效靶比时T细胞对GL261胶质瘤细胞的杀伤率,观察T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。第一部分C57BL/6小鼠骨髓源树突状细胞的培养和鉴定目的：探讨分离和培养C57BL/6小鼠骨髓树突状细胞(DC)的方法,并对其细胞形态学、细胞表面标志物进行检测,为树突状细胞的胶质瘤免疫治疗提供可靠的细胞来源。方法：获取C57BL/6小鼠骨髓细胞,联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)细胞因子对其进行诱导培养,培养第5天时添加肿瘤坏死因子a(TNF-a)促使其成熟。收集第5天和第8天非贴壁细胞,倒置显微镜观察其细胞形态学变化,流式细胞仪检测其表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的表达。结果：利用GM-CSF和IL-4可以从C57BL/6小鼠骨髓细胞中诱导培养出DC,培养第8天可见到典型的DC细胞形态。培养第5天未成熟DC的CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表达率分别为CD8011.98%, CD864.08%, MHC-Ⅰ6.90%, MHC-Ⅱ37.68%;培养第8天成熟DC的CD80、CD86、MHC-I和MHC-Ⅱ表达率分别为CD8097.40%, CD8691.99%, MHC-Ⅰ97.25%, MHC-Ⅱ98.71%。结论：利用GM-CSF和IL-4可以从C57BL/6小鼠骨髓细胞中诱导培养,可获取足量高纯度的DC,为DC的肿瘤免疫治疗提供了细胞来源。第二部分肿瘤抗原致敏DC诱导肿瘤杀伤效应的实验研究目的：探讨氩氦冷冻胶质瘤细胞冻融产物对C57BL/6小鼠骨髓源树突状细胞(DC)成熟的影响,以及致敏DC诱导肿瘤杀伤效应的作用机制。方法：采用氩氦冷冻法冻融GL261胶质瘤细胞为实验组,只插入探针不冷冻为阴性对照组,冻融等量PBS为空白对照组,采用BCA法测定冻融产物蛋白浓度；体外诱导小鼠骨髓细胞为DC,加入冻融产物后观察其形态学变化。流式细胞仪检测DCs表面CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达。ELISA检测其上清液中IL-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-12含量；提取脾脏T细胞,与DC共培养后CCK-8检测DC与T细胞比为1：10、1：20、1：40、1：80时T细胞的增值活性及分泌IFN-y的量；以GL261细胞为靶细胞,以各组冻融抗原致敏DC活化的T细胞作为效应细胞,效靶比分别为5：1、10：1、50：1和100：1时CCK-8法检测DC激活的细胞毒性T细胞(CTL)对GL261胶质瘤细胞的杀伤率。结果：实验组肿瘤抗原量高于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；实验组具有典型成熟DC形态,表型CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达率及IL-6, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-12分泌量显著高于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；DC与T细胞比为1：10、1：20时实验组T细胞增值活性高,与阴性对照组及空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；实验组DC与T细胞比为1：10、1：20、1：40、1：80时IFN-γ分泌量较高,与阴性对照组及空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；不同效靶比时实验组CTLs对GL261细胞的杀伤率显著高于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：氩氦冷冻胶质瘤细胞可获取大量肿瘤抗原并可促进DC成熟,冻融产物致敏DC后可有效负载肿瘤抗原而产生抗肿瘤效应,为氩氦冷冻靶免疫治疗胶质瘤提供了实验基础及理论依据。