论文部分内容阅读
目的研究低氧条件下肺动脉内皮细胞(PAEC)向平滑肌样细胞的转分化及转化生长因子β1(TGFβ1)在此转分化过程中的作用。方法1.胰酶消化法获取猪肺动脉内皮细胞,并用免疫磁珠法(以PECAM-1/CD31阳性表达作为分选标记)对原代肺动脉内皮细胞进行纯化;2.形态学观察结合免疫组化检测Ⅷ因子和CD31对内皮细胞进行鉴定;3.实验分组:将纯化后的PAEC分成四组:(1)常氧组(N)(含21%O2,5%CO2和74%N2);(2)低氧组(H)(含1%O2,5%CO2,94%N2);(3)常氧+TGFβ1抑制组(N+TGFβ1 Neutralizing Abs);(4)低氧+TGFβ1抑制组(H+TGFβ1 Neutralizing Abs)。各组分别培养1、4、7天;4.平滑肌样细胞的鉴定:形态学观察结合免疫组化检测平滑肌标志性蛋白α-SM- actin,判定有无平滑肌样细胞的转分化;5.用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测常氧和低氧组细胞TGFβ-1mRNA.;6.免疫印迹(Western-blot)检测常氧和低氧组细胞TGFβ-1蛋白的表达。结果1.免疫磁珠纯化可剔除内皮细胞中的杂细胞,获得高纯度的内皮细胞。纯化后的内皮细胞相差显微镜下观察呈典型的铺路石样外观,免疫组化检测Ⅷ因子(FⅧ)和CD31呈阳性表达。2.平滑肌样细胞的鉴定:形态学观察转化细胞呈梭形,免疫组化检测α-SM- actin呈阳性表达。3.各组细胞转化率比较:第1天各组均未出现平滑肌样细胞的转化(图7、8);第4天和7天N组未出现转化细胞,H组出现转化细胞,且第7天H组转化率明显高于第4天H组转化率(P < 0.05);阻断TGFβ1的作用后,第4天和第7天H+ TGFβ1 Neu Abs组的转化率分别低于其对应的H组(P < 0.05),其余各组均未见转化细胞。4.低氧可增加肺动脉内皮细胞TGFβ1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论1.磁珠分选法是一种有效的细胞纯化方法,可高效快捷的分离纯化出高纯度的血管内皮细胞。2.肺动脉内皮细胞中存在具有转分化为平滑肌样细胞潜能的细胞;3.低氧可明显促进内皮-平滑肌转分化;4. TGFβ1在此转分化过程中起促进作用。